→ Ice9: 真不能換 primer? primer長度多長？可有再延長設計的可能？ 04/29 09:55
27個mer 我只是個菜鳥助理 現階段的處境就只能先試條件
→ Ice9: 然後，10K 產物用 Taq? 有一定程度的 mutation 耶。 04/29 09:56
Pusion polymerase其實不算Taq 我只是怕有人沒聽過 那我改一下好了
推 pwl: 不曉得你有沒有試過DMSO？ 04/29 11:29
有喔
→ pwl: 抱歉，漏看條件了，原來已經加了 04/29 11:30
推 huuban: 如果是Phusion做10k應該沒有問題，我認識的Phusion不是Taq 04/29 12:13
你是對的
→ huuban: template做別的PCR能做出東西嗎？搞不好根本壞了 04/29 12:14
沒試過P其他東西 那但我有自己重新轉殖抽plasmid 新舊結果一樣
→ huuban: primer TM可否再拉高？ 04/29 12:15
嗯 我試試
→ blence: 完全互補又不能改的primer好像早期stratagene的Quikchange 04/29 16:47
→ Ianthegood: phusion改版過喔 primer試0.5uM看看 然後我會把single 04/29 20:19
→ Ianthegood: side再拉到10 cycles 04/29 20:19
所以你覺得要提高primer量?
另外first stage增加cycle數不會像用PCR product當template一樣非常容易smear嗎?
雖然我目前的狀況也很像這樣orz
→ xxtomnyxx: 你的 template 10K 然後你要從上面 P 多大的片段？ 04/29 21:30
→ xxtomnyxx: Phusion 我通常超過 3K 的都用 1 kb/40sec 去做。 04/29 21:31
→ xxtomnyxx: 我看你來你這個 smear 技不向 template DNA 也不像做 04/29 21:32
→ xxtomnyxx: 不完整的 amplicon...... 可以給 marker 的大小嗎？ 04/29 21:32
sorry我講的不夠清楚
<補充>
先前長官給我一個10K plasmid跟一對完全互補的primer
要我做mutagenesis 直接P出一個完整的plasmid
我是用1 kb/15sec來做的
另外下面是我用的ladder
http://i.imgur.com/Y7cyrbZ.jpg
※ 編輯: ccclaz (118.167.200.167), 04/29/2016 23:06:12
→ blence: 我覺得你沒說清楚是site-direct,是很大的誤導, 04/29 23:19
→ blence: 出問題的點已不只是pcr條件,連要mutation的設計也要存疑 04/29 23:22
→ blence: phusion有出mutagenesis的kit,可以照它protocol修改一下 04/29 23:23
→ blence: 追根探討,上面的人得讓你多了解細節,才能更快解決問題 04/29 23:26
→ blence: 補充下,phusion已不用完全配對了,所以才說上面的人要費心 04/29 23:29
推 jeol1620: 試試看 68℃ 1kb/30sec 或是反應液陪完再多加0.5ul taq 04/29 23:39
→ xxtomnyxx: 我確定一下，你的 primer Tm 是照 Phusion 的算法算的? 04/30 01:54
→ xxtomnyxx: Phusion 的 Tm 跟普通 primer 在用的不一樣，然後請改 04/30 01:55
→ xxtomnyxx: 用 1 kb/40 sec 試試看。 04/30 01:56
→ xxtomnyxx: 另外，用完全互補的 primer 做 SD mutagenesis 是否搞 04/30 01:59
→ xxtomnyxx: 錯了什麼？怎麼跟我印象中的做法不一樣？ 04/30 02:00
→ Ice9: 現在做 mutation 不需要用到 two-step 了啊。而 primers 互 04/30 13:32
→ Ice9: 補是常用方法。另外，你的 mutation 往各自的 3' 端會不會 04/30 13:34
→ Ice9: 有非常高的G/C比例，也要考慮一下它們的作用。然後，跑膠時 04/30 13:35
→ Ice9: 最好加個對照組：原plasmid和切過一刀的等等。 04/30 13:36
→ blence: 最早期SD的stratagene protocol就建議用完全互補阿 04/30 21:13
→ blence: x兄可以看一下Quikchange manual 04/30 21:17
→ blence: SD就是要省掉ligation步驟,還加ligase就可惜這設計了 04/30 21:20
→ xxtomnyxx: 喔喔原來如此！但這樣我有個疑問，在PCR結束後加一個緩 04/30 21:47
→ xxtomnyxx: 慢降溫的 hybridization 步驟會不會比較好？ 04/30 21:47
→ xxtomnyxx: 補充，94 C 3 分鐘後再緩慢降溫。 04/30 21:48
→ soom: 也許每個case不同，但個人經驗中Quickchange跟inv-PCR 04/30 23:15
→ soom: Quickchange做了快一個月沒出來, PCR+PNK+Ligase一次就成功 04/30 23:16
→ soom: 不過這是個人經驗，僅供參考 04/30 23:18