[求救] HMW protein detection

[tynse71864 (TATA box)]

版大們晚安

小弟最近在處理一個~250kDa的protein

但western一直都壓不太出來....(以下會詳述)

有逛了一些討論版 但還是做不太出來/很醜

因此想上來請問一下大家的看法


1. 由於我的protein是lipo外送的

理論上量會很多 (以前paper也很多人做過)

我是想問   如果我今天送一樣量 (ex:10ug的DNA)

一個是表現10kDa的蛋白 一個表現250kDa

兩個表現量會有差別嗎? (還是一定要考慮protein的modification)


2.Cell lysis

目前是用0.2% NP40 lysis bfr做 學長之前做出來的條件

rocker 轉+ vortex 15min (會太短嗎? )


也因為此protein會secrete, condition medium會外加至0.2% NP40 & 1mM PMSF

去掉cell debris後放冰上


之後Lysate 跟medium 做IP o/n, wash三次後加2x smp bfr 煮


(有試過不IP直接跑  看不到一點痕跡

別的實驗室做此protein, 即便是外送 都還是會IP  所以照做)




3.SDS-PAGE

我之前是跑4%的gel  但我上膠是5%....

這會影響嗎?  (跑出來是歪歪扭扭的沒錯 但想確認； pH上6.8下8.8)


跑膠條件: 90V  約2hr ( Biorad tetra cell system)

Running bfr 是tris-Glycine SDS (就一般用的)

Marker是Thermo 的Spectra MR (Max 300kDa)


PS 此情況下 marker位置準嗎?



4.Transfer

條件是根據討論版的結論測的  125mA 120mins

Transfer bfr: Tris-Glycine / 10% MeOH / 0.05% Tw20

(建議SDS或tw20或不加的都有,我就用較weak的)

 transfer完後 marker都有過去



後續處理就是一般的western方法 之前做到130kDa的protein都沒問題

(抗體的部分 因為我學長壓的出來 所以應該不是這問題

但跟一般100kDa以下的壓出來算是不太好看  )


就這個250的一直壓不出來...

希望大家能給一些意見~~

謝謝



--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.228.136.116
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1462720320.A.33E.html
→ blence: 如果,一個protein沒有特殊理由都得先IP才能用WB偵測,那表
→ blence: 示抗體有根本的問題:請先了解抗原-抗體特色,與IP的目的
因為不只我們實驗室啦@@...10幾年前的paper~最近 用Hela/COS-7做外送 還是會先用IP enrich (或是TCA 沉澱)
而且抗體跟我們家現在用的不同隻

我也想過這東西真的有少到一定要IP嗎 所以才有 1. 的問題

但我要認真想一下我家抗體是不是壞掉...囧

→ blence: 我做3,400kd才用6-7.5%PAGE,250kd而已的大小不太是問題
目前也正改用6% gel

想請問一下B大的跑膠及transfer條件是?

→ blence: 你內容說學長做的出來,那應該先問他?(還是又畢業離開了?)
還在XD  但他習慣跑大片膠  我不太會處理大片的 所以跑小的
因此跑膠condition有些差異
剩下基本上是完全發樓

推 joseph103331: 1當然會有差, plasmid的量決定在鹼基多寡, 兩者
→ joseph103331: 大小差這麼多, plasmid個數根本不能相比
→ joseph103331: 有點口誤, DNA的量決定在鹼基多寡, plasmid的量就需
→ joseph103331: 要考慮到質體的大小, 同樣10ug, 10kDa的絕對比
→ joseph103331: 250kDa的表現質體多非常多個,表現量就會少很多倍了
J大說的就是我一開始想的點...

→ blence: 用plasmid多寡來解釋表現量看似合理,但如果不是以定量RNA
→ blence: 而是WB,不同的抗體是無法證明表現量差異
→ blence: 而且實際算一下plasmid,100bp跟5.5bp,看似差55倍,但如果接
→ blence: 到pcDNA3上,一個copy變成5.6k與11k的差異,只差兩倍而已
→ blence: 或許不同長度的轉錄效率,比plasmid的copy差異還大很多
謝謝b大 你順便幫我解決了一個快兩年的問題....
那假若我今天在兩個protein後都接Flag 並用flag 做western 應該可以解決抗體的問題?

→ Ice9: WB不容易測到，除了抗體問題，還有可能從一開始就有問題啊。
→ Ice9: Plasmid Seq 壞了，Transfection 效率差(你的對照組如何？)
→ Ice9: 跑膠時的量——大片膠不難搞，你應該學著如何建。
→ Ice9: 既然以前很多人做過，那蛋白修飾問題應該不是影響你結果的主
→ Ice9: 要因素。另外，目標細胞的狀態也有可能會影響結果。
→ tynse71864: 先謝謝各位 這幾天想了一下後再來板上回應
plasmid跟seq都是對的喔  Hela transfect大概6~7成,細胞狀態應該OK
其實大膠我會  就只是單純覺得如果小膠可以  為何不能跑小的就好 (因為就看一條band)
※ 編輯: tynse71864 (36.225.70.25), 05/13/2016 12:23:00
→ blence: 想這樣比較表現量還是從RNA著手;同一construct把tag接N或C
→ blence: 抗體偵測都可能不同了,何況不同蛋白變因更大
→ blence: 如果是同construct的delete或mutation,應該就方便這樣比較
因為我的 wt跟 mutant protein， 每次外送 結果表現量都不一樣多 (但 wt一定比較多,只是看多幾倍)； 但試過接 flag後外送, IB Flag 表現量就會一樣。 抗體是bacteria recombinant wt protein打兔子來的
※ 編輯: tynse71864 (42.73.20.24), 05/13/2016 20:29:34
→ tynse71864: 我會在 check 看看,非常感謝
※ 編輯: tynse71864 (1.171.39.66), 05/15/2016 11:18:41
→ Ice9: 大片跑下來，大MW可以比較漂亮的。你確定只會有一條band?
→ Ice9: wt和mt表現量差到兩倍以上，不是就足以讓你們探討其中的問題
→ Ice9: 了嗎？會不會是穩定性變低了，或對細胞很不友善？XDD
→ blence: 好像越看不懂了,前面講HMW壓不到,後面又可以看到wt,mt差異
→ blence: 會不會你只是mt表現的問題,就無關跑膠至WB的過程了阿