Re: [求救] 請教製作stable clone cell line花的時間

[silverberry (平行線上的交集....)]

原文恕刪 m(_  _)m
第一次發長文，排版不良請見諒。

剛好過去有建立 stable clone cell line 的經驗，
在這裡跟大家分享。

---------我是分隔線---------

目前常用的病毒轉染系統有
retro, lenti, adeno, adeno-associated virus
各有優劣和適用範圍，可以搭配實驗室的需求挑選 (1)。
廠商 Clontehc 有詳細的比較 (2) http://goo.gl/cVecku


簡單來說，可就三大部分考慮
host
 雖然這些病毒系統的感染效率都不錯，但是總是會遇到一兩個難搞的 host cell line。
 另一個關鍵是 host cell 會不會分裂，這與病毒感染機制有關。

genome integration
 載體/外源基因嵌入 host genome，雖然相對於以 episome 形式來說，
 更能確認不會在細胞複製過程中消失。
 但是嵌入 host genome 的位置可能會影響 host 本身的特性；
 或是受到 host genomic DNA epigenetic modification 的影響改變外源基因的表現。

transgene property
 幾個？多大？表現量要多高？
 不同的病毒載體有不同的特性，載體設計也可以增加自由度。
 配合實驗室需求，挑選最適的系統可以減少額外的變因。


在這裡 (因為個人偏見) 以 lentivirus system 為主 (3)。

流程大概可以簡化為
virus packaging → infection host cells → selection

virus packaging
 合適的 HEK293T cell 作為 virus packaging 的 host。
 不加準備 packaging vector 的準備時間，
 被轉染的 HEK 293T cell 可以在 48-72 h 把 lentivirus 做出來。
 新鮮的 lentivirus 可以直接感染 host cell，或是分裝冷凍在 -80 備用 (4)。

infection host cells
 把 lentivirus 病毒液加到 host cell 培養基中。
 理論上 24 h 就可以觀察到外源基因的表現。
 有時病毒對 host 太毒，host 會病懨懨的。
 感染條件稍微微調一下，host 在去除病毒液之後，都會慢慢好轉。

selection
 常見的 drug selection 的 killing curve 漂亮的話，drug 篩選效果都不會太差。
 用 GFP/RFP 等等的 reporter，用 FACS 篩選也很方便。
 一切都是配合實驗室的設備和後續實驗的需求。


時程和工作量上，stable pool 和 stable clone 會差很多。
主要是 single cloning 的效率和工作量。
參考廠商的網頁 http://goo.gl/ykbfzm
雖然這張圖是 CRISPR 的流程，感染兩次 lentivirus。
不過一個 stable pool 和 clone 大概就是 2 週和 6 週的差別。
(當然是指一切就緒順利的情況下~)


到這裡為止，差不多就有想要的 cell line 可以繼續做研究了 (5)。


備註
(1) 因為 iPS 很紅的 sendai virus 沒被列入討論。
(2) 有不少廠商都有賣這些系統。學校裡花小錢建立系統的方法也有很多~
(3) 未來 CAR-T 都可以打進人體了，lenti 系統 (對操作者) 的安全性應該 ok~
(4) 新鮮的病毒液配合需求盡快進行濃縮、純化、定量，4 度暫存的時間越短越好。
(5) 如果擔心細胞株穩定性，可能還要做一些穩定性測試等等，或是鑑定嵌入位點。


---------我是分隔線---------

感謝收看 m(_ _)m
當初進入這個領域時，受到版友大大們的照顧。
以這篇 "心得文" 再次感謝領進門的版友師傅們。
也希望可以大家可以一起分享心得~


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.128.137.104
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1465367650.A.857.html
→ silverberry: 第一個網址
→ silverberry: Clontech -> Products >  Viral_Transduction >
→ silverberry: Selection_Guides >  Comparison_of_Viral_Systems
→ silverberry: 第二個網址
→ silverberry: google "dharmacon lentivirus stable cell line"
→ silverberry: 第一張圖就是了
→ milkpa: 應該是293"T"細胞吧
推 aceliang: 應該沒有人拿HEK293來package病毒唄~
→ milkpa: 雖然用293不是不行，但產量應該是有差的
→ Ice9: 網址找地方縮一縮再貼上行不通嗎？
推 jabari: 好文~ 幫幫 第一個 http://goo.gl/cVecku
推 jabari: 然後第二個應該你是要說流程吧? http://goo.gl/ykbfzm
→ jabari: 感覺CRISPR/Cas9真的是好恐怖的工具  千鈞一髮要來了嗎?
※ 編輯: silverberry (36.225.44.195), 06/12/2016 18:14:13
→ silverberry: 已改 HEK293T。
→ silverberry: 因為我們實驗室之前不是做這塊的。所以 HEK293 cell
→ silverberry: 是跟別的實驗室要來的。大家的標示都不太清楚 Orz
→ silverberry: 我還用過一株 HEK293FT，因為 passage number 很低
→ silverberry: 和另外一支標示 HEK293 低代數的效價都很好，
→ silverberry: 這個部分還請大家分享~
→ silverberry: 我一開始用 ppt 短網址，post 被說是廣告 @ @
※ 編輯: silverberry (36.225.44.195), 06/12/2016 18:18:55
→ silverberry: 感謝 ja 大的縮網址~文章已修改。