[求救] ligation失敗

[angel810801 (陰雨綿綿)]

各位好  最近在做一個clone
但是轉型後  一直沒有長出菌落
勝任細胞是使用市售的DH5a
因此懷疑應該是ligation的部分出問題

以下是我做的條件

vector大小為5400 bp
insert大小為1000 bp

兩者 RE 剪切完後clean up

vector 濃度為 23.5 ng/ul
insert 濃度為 10.5 ng/ul


使用I:V=3:1的比例去接，vector加入的量訂為100ng

insert       6 ul
vector       5 ul
ligase       1 ul
10X buffer   2 ul
ddH20        6 ul
_____________________
             20 ul

ligation的時候，會先將除了ligase外的，先以45度加熱5分鐘
之後再加入ligase

有嘗試過(1)4度 O/N
        (2)16度 1.5 hr → 4度 O/N


最後用 5 ul 加入勝任細胞做轉型(因為>6K，所以有做heat shock)
結果一顆菌落也沒有長...

我們ligation buffer買來就有分裝成小管
每次要用才拿一管出來
因此應該沒有反覆冷凍解凍壞掉的問題....



請問
(1)是我insert和vector加的量太少嗎?還是應該提高I:V比例(1:5 or 1:7)?
(2)還是我ligation的的時間/溫度不對?

另外想問  如果ligation有剩下的
可以放到-20下次再拿出來直接轉型使用嗎?

先感謝各位的幫忙 > <


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推 tony51501: 我vector濃度都大概1.x ng/ul
→ tony51501: 你用的抗生素？盤子抗生素濃度？
我是使用kanamycin 30 ug/ml
→ darkdoor: 可以嘗試16度overnight
推 elite2: ligase buf.裡面有ATP不要去加熱！效率會變很差
→ elite2: 另外，12-16度overnight會比較好～
加熱是老師給的建議，說他以前的做法
好  我會改試試看16度 O/N
→ hitmd: 跟別家做的出的借一下ligase，有時候活性有差
LAB其他人也都用同樣的東西做 但是有成功><....
※ 編輯: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:43:13
推 oceanl: heat shock後有放培養箱recover嗎？有試過把20ul全下嗎？
市售的protocol沒有寫放培養箱recover....我下次試試看
因為他是建議加入的DNA量不要超過1%(一管是100ul)
加上之前我們老師也是說最多不能超過5 ul
20 ul 全加不會給勝任細胞太多壓力嗎?
※ 編輯: angel810801 (140.121.155.195), 06/08/2016 17:50:37
→ blence: 同一樓看法,Kan仍建議recover;DNA方面5-10%就好,20太多了
→ blence: 不過ligation與其補水,而且才用5ul,不如控制體積10ul以內
推 qazbamboo: 我大部分都放室溫一個小時跟勝任細胞10:50
推 lail: kan的菌要recovery+1, 然後我以前ligation是在室溫3-4小時（
→ lail: 隔壁學姐室溫1小時），給你參考
→ Ianthegood: 量多沒好處, ligase一般都建議vector 50ng當基準調整
→ skyken10: 跑個膠確認一下ligation的效率！
→ blence: 跑膠? 以10^7效率看1ng就有1萬顆了,1ng跑膠看得到?
→ blence: transform長起來的DNA量,遠少於跑膠偵測的靈敏度極限阿
→ Ice9: 試試ligation完加熱一下，某種程度上可增加transform效率
推 aaaazzzz: 先前也遇到ligation完全沒長(kanamycin),後來步驟多了LB
→ aaaazzzz: 加入後，置放37度45分鐘就有長了
推 joseph103331: 我用Quick ligase, 室溫15分鐘就好了
→ joseph103331: 如果vector沒有做切膠分離, 完全沒長肯定是ligase
→ joseph103331: 或是沒有recover的關係, 參考產品protocol去做就好,
→ joseph103331: 先不要用一些其他的經驗去操作
推 tynse71864: recovery +1 ligation 有這步比較好長～ 趕時間大概15
→ tynse71864: -20分鐘就行了
推 o81628: 學姊我在這（舉手）
→ osla30: 不要用cleanup改跑膠切膠純化試試
→ osla30: insert與vector以65度加熱5分，冷卻後再加ligase與buffer
→ osla30: 試試
→ osla30: insert我通常會給多一點
推 qumai: 勝任細胞體積多少? 加了5uL ligation product 已經很多了
→ qumai: Kna一定要recovery不然效率會很差, heat shock之後加SOC
→ qumai: 37度搖一個小時吧, plate也37度C先溫一下
推 jamesonly: 我自己還會額外加ATP>< 怕buffer的沒用了