[求救] DNA Gel extraction的效率很差

[gustpigex (鼻子好像灌太多了)]

各位好，最近剛做gel extraction的實驗，但recovery的效率非常的差，想請各位幫幫忙。

我是先用2 microgram的plasmid先用限制酶切，分離後切下來，我所要的DNA大小約13kb。
接下來是使用QIAGEN的kit做gel extraction，步驟都照著protocol做，wash的步驟加buffer後有等一陣子再離心,elute的時候又是加了水之後等一陣子才離心。我是用15 microliter的量做elution。最後用nanodrop測濃度。
做了好幾次濃度都在1.5(ng/ul)，也太低了吧。
目前已排除plasmid切不完全的問題，因為不管切4hr還是切overnight濃度都差不多。

想問的問題是
(1)用kit內的elution buffer效果會不會比水好。
(2)elution buffer的體積會不會有影響。
(3)我們實驗室是用QIAGEN的PB buffer做binding,但protocol是寫QG buffer，雖然兩者都可以拿來做binding，但不知道效果有沒有差。
(4)有沒有其他的小細節要注意的，或是有其他更好的kit


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→ blence: 你有看過manual上那張elution體積與回收率的關係圖?
→ gustpigex: 有，但是同實驗室的人用相同體積做，濃度就是比我高十
→ gustpigex: 倍…
→ xxtomnyxx: Elute 的溶液有沒有先加熱？用水和 TE 效果差不多，主
→ xxtomnyxx: 要是差在 DNA 穩定性還有 EDTA 對後續實驗有無影響
→ xxtomnyxx: 我想問為什麼 protocol 寫用 QG 你還要用 PB buffer?
→ blence: 濃度就算高你10倍，回收率也才11%，也很慘
推 as862437: 找人跟你side by side 做一次
→ sy2: PB buffer只適用於液狀的PCR product純化，本身沒有溶膠的成
→ sy2: 分，請改用QG buffer並注意膠塊大小與QG的比例，放65度C以上
→ sy2: 的環境，大約每5分鐘搖晃一下，看一下確保膠塊溶解後再過
→ sy2: column
→ sy2: 液狀的PCR純化也可以用QG buffer，但因含GITC，自己配QG的話
→ sy2: 成本比較高。
→ gustpigex: 為什麼改用PB據說是因為更之前的學長姐在他的產品的pro
→ gustpigex: tocol上把wash那一步的QG buffer劃掉 寫PB 之後大家都
→ gustpigex: 照著做  但那份protocol不見了…  我是新來的  我就上
→ gustpigex: 網看才發現是用QG 我自己也覺得很奇怪  但詢問學長姐的
→ gustpigex: 回答都是他們都照那份protocol做
推 mswei: 我以前用這組覺得elute的體積太少elution
→ mswei: 的效果也不好我自己都加到30 microliter
→ mswei: 然後你的target size 13kb～這組可以抓到
→ mswei: 這麼大的DNA嗎？
→ gustpigex: 建議是最大抓10kb 若超過的話elution buffer要加熱
→ Ice9: 以前没有kit時，用的是5-10 microgram切下去，分離後以電泳
→ Ice9: 在dialysis bag收集。之後再洗洗、沉澱回收。
→ Ice9: 有了kit，儘量不要隨意更動步驟，除非你知道差在哪裡。g大的
→ Ice9: 加熱建議最好試一試，13kb是相對大了一些，效率問題大。
→ Ice9: 建議再加大elution體積或再elute一遍。最後再蒸散些水份。
推 AuroraSky: 我覺得Q牌很邪門，全世界都說讚但我遇到的三間實驗室
→ AuroraSky: 都用不順，後來改用Zymo就可以上到70-80ng/ul,
→ AuroraSky: 260/280 > 1.9, 260/230 > 1.9 有人有在用Zymo的可以
→ AuroraSky: 分享我後來修改的protocol, 小細節注意一下產率就很好
→ sy2: https://goo.gl/EntM6n，QG & PB 是分別對膠體與液狀PCR設計
→ sy2: 的純化binding buffer，至於你說的wash由QG改成PB是怕
→ sy2: guanidine鹽類殘留，膠體的溶膠步驟要用含GITC或NaI的buffer
→ sy2: 並且膠體純化binding過cloumn後，在酒精wash前會用QG wash一
→ sy2: 次可減少膠體殘留。若沒QG buffer溶膠，可以拿其他廠牌溶膠
→ sy2: buffer代替，成分大同小異。
→ sy2: 你的產量低，可能一開始膠沒溶完全。溶膠請用QG，wash可改PB
→ sy2: wash一次，再用80%酒精或kit的 Wash Buffer(要加酒精) wash。
→ sy2: sorry 上頭寫錯，改PB不是減少guanidine鹽類殘留，因為PB成分
→ sy2: 是guanidine-HCL，而QG是guanidine thiocyanate，都有Gu鹽。
→ gustpigex: 謝謝大家的回應回報最新實驗結果，今天我用了Q牌，gene
→ gustpigex: aid(借的）和Q牌抽大sizeDNA的kit，全程照著protocol做
→ gustpigex: ，elution的水有事先加熱且用30ul，建議多等的步驟也有
→ gustpigex: 做。
→ gustpigex: Q牌的濃度為2.5(ng/ul)，G牌為12.5，Q牌抽大kit為6.5
→ gustpigex: 雖然量都有提升 但Q牌還是很低，想請問各位會不會是kit
→ gustpigex: 壞了……因為他們放有點年紀了。
推 lail: 也有可能，曾經一起比，放很久的kit回收率真的比較差
推 ad1980: 你的 plasmid 是 empty vector 嗎？是的話也沒有想過用 ph
→ ad1980: enol/chloroform 試一下看看，我之前都是用這個做 cloning
→ ad1980:  (cloning)，效果不錯，recovery 也高。
→ ad1980: Cloning (ligation)
→ ad1980: 如果要乾淨一點的話就用 pcr purification 清一下，不然
→ ad1980: 直接拿去做 ligation 也 ok。
→ ad1980: Phenol/chloroform extraction
推 ararthur: 我的經驗是Gel ext kit放久蠻容易失敗的 大家經驗呢
→ osla30: 我記得column有效期？