[求救] 有關質體定序

[polomi (POLOMI)]

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有關質體的定序問題

我是用pUC18作為載體，

送入一段約1.1K的序列。

以BamHI/EcoRI作為切位，

過程中都有跑膠切膠純化。

定序之後結果都有很多不同的點突變產生，

後來也將原本的pUC18送去定序，

利用其質體上M13F-40與M13R-48去定序。

兩者中間為MCS片段，

與原本的pUC18序列比對，

發現在465位置上少了一個G，

1062位置的A變成了T。

http://imgur.com/C9iLMBN

這是否代表了我的pUC18是確定有問題的。

也造成了質體是否會影響細菌不正常生長的可能性?

而我也有做藍白篩篩選，

在DH5a下送入pUC18 的確會產生藍斑的。

請求各位幫助了。

邁入碩班的第三年了...

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1466773921.A.4BC.html
→ xxtomnyxx: 定訊螢光訊號的圖呢？然後要去找到這個突變點在哪裡不
→ xxtomnyxx: 是很簡單？那就看看有沒有突變在重要的 feature 上啊！
→ xxtomnyxx: 喔好，我幫你查完了，突變點在 ori 上，這是很重要的序
→ xxtomnyxx: 列，但是在我手上的資料那個序列本來就是 T
→ xxtomnyxx: 我實在很想說而且也說出來了，碩班念完兩年這不是基本
→ xxtomnyxx: 功中的基本嗎？還是說你不是分生領域的碩班？
→ polomi: 對不起，我是化學所的碩班.....我會再多加努力的
→ polomi: 現在吃飯中，今天或明天會放上來定序的訊號圖，可以的話，
→ xxtomnyxx: 你的 pUC18 的序列是實驗室的前輩給的嗎？有可能是前輩
→ xxtomnyxx: 給的序列有錯喔。建議你上網搜尋 pUC18 的 序列來比對
→ xxtomnyxx: 看看。
→ xxtomnyxx: 另外，你如果是用一般的 Taq polymerase 把 DNA 放大再
→ xxtomnyxx: 切酵素跑膠純化然後接到 pUC18 的話，1.1K 是有可能有
→ xxtomnyxx: 突變，通常要做 cloning 的時候用的 polymerase 會是比
→ xxtomnyxx: 較高級的 High-fidelity polymerase
→ e104582001: 有時候定序不要只是看序列，有問題的地方要看該位置訊
→ e104582001: 號的 pick 的單一度，有時候可能是誤讀
→ blence: 猜,不是真的有突變,而是1.1k太長,訊號不佳軟體誤判pick
推 Invec: 加油
→ blence: 至於那2個點突變,其實把addgene跟NCBI的pUC18來blast就會
→ blence: 覺得pUC18的序列應該不只一個版本