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各位高手們好,魯妹最近在趕畢業無奈western狀況連連,請大家幫幫忙 我的目標蛋白是FAS 273kDa, internal control是tubulin 50kDa,牌子都是cell signal 的,抗體分別稀釋1000x和5000x 條件是:8%下膠 上膠4% running:80V 跑160min transfer buffer用10%meOH,400mA 跑150min冰浴放冰包 但結果都是這樣,以下是二重複,左右同一片膠 http://i.imgur.com/RuDbd2e.jpg 本來以為是sample再煮蛋白時溫度不夠高,但後來重新製備後FAS還是高高低低的 之前同學用一樣的條件都有壓出來,但我就是無法QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.140.93.89 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1467026997.A.E0E.html
jieyuwang: 是running buffer 溢出來嗎? 06/27 21:57
hotchily: 沒有漏喔 06/27 22:35
xxtomnyxx: 你在跑的時候 Dye 長怎樣? 06/27 22:37
hotchily: dye是正常的直直的跑下來 06/27 22:39
xxtomnyxx: 你收一個大量的 sample,然後把這個 sample load 到除 06/27 22:49
xxtomnyxx: 了 marker 的 9 個 lane 裡跑跑看,如果 9 個跑一樣位 06/27 22:50
xxtomnyxx: 置,那就不是 gel 的問題,可能你的 sample 有 degrade 06/27 22:50
xxtomnyxx: 或是這個蛋白直本身就會被裁切或修飾 06/27 22:51
xxtomnyxx: 欸不對,連 tubulin 都有歪斜..... 06/27 22:54
xxtomnyxx: 你請做的出來的人幫你做 gel 給你跑跑看,如果還是有問 06/27 22:55
xxtomnyxx: 題那應該是你的 sample 處理有狀況 06/27 22:55
hotchily: 所以不會是機器的問題嗎?電壓不穩或transfer過頭了? 06/27 22:57
tz2733: sample怎麼收的? 06/28 00:16
tz2733: 另外..marker合一下可能可以給更多資訊 06/28 00:18
hotchily: 抱歉marker沒有附在上面 06/28 01:36
hotchily: 右邊圖上面被拉開的band是310kDa 下面的band是270左右 06/28 01:37
hotchily: sample是PBS wash後加lysis buffer用刮板刮下來高速離 06/28 01:41
hotchily: 心取上清液,定量完加DTT跟dye以98-100度乾浴五分鐘後存 06/28 01:41
hotchily: 於負20 06/28 01:41
duriamon: 可能有兩種原因,樣品鹽濃度太高或不一致和DNA太多樣品 06/28 14:34
duriamon: 太黏。 06/28 14:34
tynse71864: 有試過不凍直接跑嗎 07/02 09:44
hotchily: sample是都會凍要跑時才回溫.. 07/02 16:16
hotchily: 會試試看大家說的方法的真的很感謝各位高手們 07/02 16:16