[求救]PCR一直跑不出來

[pongpongding (胖胖丁仔)]

大家好，實驗室同伴跑PCR一直跑不出來，這實驗曾經一度有做出來過，只是後來不知怎
麼地就一直失敗，持續失敗了半年，也爬過很多文，就是找不出方法。實驗室的學長、助
理(我)都跳進來幫忙做過，因為大家都是這方面的新手，所以一開始一直以為是操作問題
，所以用相同的條件重複了n次，primer、polymerase也都重買過，還是出不來。後來因
為有了positive control，positive control 都有跑出來，但想要的 gene 就是跑不出
來，而且都有拖帶，希望大家能給一點改善的意見，謝謝！

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我們有 blast 確定設計的 primer 專一性沒問題，也可以夾出要的 gene。
F primer 的長度是36, GC%=44 Tm=64.4
R primer 的長度是37, GC%=54 Tm=68.9
gene大小是 2.8 kb
postive control是 2 kb

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下面是幾張在有postive control後，跑膠的結果

一開始用的是下面的條件：

PCR program：
     1. 95’c, 30sec
        45~55’c, 30sec
        72’c, 2mins     (35 cycles)
     2. 72’c, 8mins
     3. 16’c, hold

genomic DNA template ： 50 ng
dNTP：500 μM
F&R primer：0.5 μM
10x buffer：2 μL
sterile DI water：13 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units
     *total reaction： 20 μL

http://imgur.com/psXkP16

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爬了一些關於有拖帶的文章，看到了幾個可能原因：
1.template濃度太高
2.dNTP濃度太高
3.primer濃度太高
4.cycle數太多
5.annealing溫度太低
以及有些版友推薦在 reaction 加 1~5% 的 DMSO

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所以做了一些改變

PCR program：
   1. 95’c, 30sec
   2. 95’c, 30sec
      50~65’c, 30sec
      72’c, 2mins 30sec       (30 cycles)
   3. 72’c, 8mins
   4. 10’c, hold

genomic DNA template ： 50 ng
dNTP：200 μM
F&R primer：0.2 μM
10x buffer：5 μL
sterile DI water：40 μL
Pro Taq Plus DNA Polymerase：2 units
     *total reaction： 50 μL

http://imgur.com/ywo2Swu

結果還是一樣拖帶....Orz


想請問大家還有其他改善方法嗎？
是應該在增加DMSO濃度？還是說還是太多cycle嗎？

版上有看到有些人建議加 Betaine，但因為看到這種解決多是增對 GC rich 的片段，加
上我們實驗室沒有，請問有需要添購嗎？

拜託大家幫幫忙了!!!!非常感謝


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.120.93.70
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1467621799.A.2F7.html
→ storm780121: 曾經一樣p不出來，gDNA再稀釋10到100x 產物就出現了
看來稀釋兩三倍太秀氣了，再來試試，謝謝！
稀釋成 5ng/50μL 結果連postive control 都沒出來了囧
推 jabari: Pro Taq應該是波士特自家的? 你買個管R牌或B牌的HF試試?
→ jabari: 或者Promega的GoTaq 有時候換Taq跑得出來
→ pongpongding: 我們是有用過t牌的 max hot start 也沒跑出來耶，用
→ pongpongding: 不推現在的taq是嗎？為什麼 postive contorl出的來
→ pongpongding: ，target gene卻出不來呢？不同基因還是會適合不同
→ pongpongding: 的polymerase嗎？(新手有點菜sorry
推 jabari: 不是不推 ProTaq我以前在120.99用得很開心 問題是有些基因
→ jabari: 跟霍青桐一樣 "那都是很好很好的Taq，可是我偏不喜歡"
→ pongpongding: 了解！再來試試看，謝謝
※ 編輯: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:10:57
※ 編輯: pongpongding (111.83.149.104), 07/04/2016 18:17:50
→ osla30: DMSO 2,4,6,8,10%都試試
好!!
結果今天試了，都沒成功，10%的在<200bp的地方竟然還出現一條band，不知為何><
→ osla30: ampliqon 2x master mix red這個很神，可以用這個試試
目前沒預算，希望用現有的資源試試看，如果還是不行再試試，謝謝提供新資源喔！
→ milkpa: DMSO+1
推 micocat: 夾gene是要表現的嗎？建議用proofreading的enzyme
         07/05 01:07
是之後要做突變的
→ micocat: template是gDNA的話denature可以更高 96~98℃
好謝謝！
→ Ice9: 2.8kb 是包含 intron?
是欸
→ Ice9: intron內的詭異序列很多。一般建議分段取得再合起來。
一開始其實是用cDNA做，一直失敗才改用quality比較穩定的gDNA，如果改回用cDNA會比
較好嗎？
→ Ice9: 然後，positive control的template也是gDNA嗎？
是，是同一個 template dDNA，謝謝唷
※ 編輯: pongpongding (114.38.149.138), 07/05/2016 07:49:58
→ blence: 要不要用gDNA或cDNA不是取決於你要不要intron嗎？
→ blence: 為什麼會說因為quality的考量,來決定用gDNA或cDNA?
→ blence: 至於你回答micocat說夾基因是要做突變,所以不用要表現嗎？
其實是因為實驗室同伴的RNA一直抽不好，造成cDNA的quality也備受質疑，所以改用確定
quality比較好的gDNA先確定實驗p不出來是不是primer的問題
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 10:23:01
→ blence: 如果改用gDNA是為了測試primer好不好,那現在data已經顯示
→ blence: 不ok,照你們的預期,不就可以認定primer,然後別再試條件了
→ blence: 又或者,既然覺得換primer也沒解決問題,也就是問題還未知
→ blence: 與其花在gDNA上troubleshooting,應該放心力在cDNA多嘗試吧
恩恩！想想也是，之前想的太草率了，一心只想趕快找出方法p出來，謝謝你耐心回覆～
→ a90648: 要測primer能不能用建議在同condition下測
→ a90648: intron上常有一堆詭異序列P不出來不一定是primer問題
恩恩，我會再從cDNA試試，謝謝。
→ Ice9: 我的建議和B大基本一樣。另外，實驗室有没有別人已抽好的，
→ Ice9: 品質基本令人滿意的cDNA，拿那個當template吧。
→ Ice9: 然後用gDNA去夾，最好先排除有没有pseudogene或多基因問題。
請問一下用blast可以確認pseudogene的問題嗎？謝謝～
→ Ice9: 呃，上述的然後是語氣上的然後，不是指事件。
推 jabari: 是說 預算這好解決...跟業代要個5rnx的酵素 來試 應該都會
→ jabari: 給
原來如此，立馬來找業務，謝謝！
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 14:48:46
※ 編輯: pongpongding (140.120.93.70), 07/05/2016 15:01:10
推 osla30: ampliqon原廠可找萬旺，另外我懷疑有幫OEM的有兩個
→ osla30: 創世紀的Q-Amp 2x ScreeningFire與圖爾思的SuperRed
推 jabari: BTW..有時候P不到 就往外面再設引子看看 說不定是indel
推 carolian: 基因序列也會影響，之前我的實驗有個基因約2.5kb，AT比
→ carolian: 例大概65%，PCR extension溫度用72℃ P不出來，後來找pa
→ carolian: per看，extension溫度改用60℃~65℃，annealing時間延
→ carolian: 長一些1.15 min/1kb就成功了，一樣用protaq，可以參考
→ carolian: 看看
→ raiyu: 5 6年前趕畢業時也一直p不出來，狠下心用master mix就p出來
→ raiyu: 了 好像是跟慧眾買的 (當時因為管帳的學長該該 所以我直接
→ raiyu: 自掏腰包買 記得價錢還不至於太肉痛)
→ raiyu: 不過後來也沒有認真找到底是哪裡出了問題 就是個學長用原本
→ raiyu: 的Taq就p得出來，我就p不出來 卡到陰的狀況
→ jabari: 自掏腰包這也太恐怖了-.-
→ osla30: master mix都不會太貴，幾百元吧，尤其量大的話可壓更低
推 jabari: 我的意思是 怎麼樣也不該學生自掏腰包-.-
→ osla30: 話說學生時期我也掏過腰包買支餵食針測試實驗XD
→ raiyu: 因為博班學長該該叫  反正我重點是"畢業" 懶得花心力去爭
→ raiyu: 不過畢業後 沒用完的我也沒留下來XD
推 qazbamboo: 前面幾個cycle 設計更低的溫度看看，我之前這樣就成功
→ qazbamboo: 了
這幾天忙著趕計畫的實驗還沒重新去抽RNA，感謝上面幾位的建議，我會再好好試試
看～
※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:07
※ 編輯: pongpongding (111.83.204.77), 07/09/2016 06:49:32
推 Alstonia: gene還蠻長的，建議檢查templeteDNA 的quality, 可以的
→ Alstonia: 話用好點的kit抽，別用那種含有機溶劑，最後酒精沉澱收
→ Alstonia: 尾的。