[求救]transfection後細胞長不好

[nellnell (小厚)]

大家好

上一篇剛好有人問了類似的問題 不過和我的情況不盡相同

也已經爬過文了 所以就另開一篇發問

最近使用HCT116細胞transfect shRNA (plasmid) 到10cm的dish中

使用的是K2 reagent這個牌子 所有transfect的量都是按照原文protocol建議

Day0的時候放入1000000(100萬)顆細胞到dish當中

24小時後用15ug plasmid以及30ul reagent來做transfection

再過24小時之後換成complete medium

然後老師是建議我在72小時的時候收細胞這樣

但是看到有幾盤都是呈現要死不活的狀態 收下來量都不多

這一次就是GFP還有sh-control兩盤看起來最慘，很多細胞都浮起來

其他shRNA收下來的量甚至比control還多

1.這樣是不是表示我這次已經失敗(因為shcontrol量還更少)

  不過我還是會跑wb看看蛋白質

2.實驗室的助理用相同條件transfect細胞都長的ok，我想不出哪邊和他不一樣

  他有說可能是我的DNA有問題，但是我之前也成功transfect過長的很好的GFP

3.因為用來繼代的那盤細胞長的非常正常，我認為是transfect出了問題

不知道有哪邊有問題請大家幫忙 ><

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 1.160.31.104
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1471061395.A.47B.html
推 tynse71864: 1.dilute用的 serum free medium有污染嗎?
→ tynse71864: 2.如果transfect 24hr後才換 medium會導致死亡， 試試
→ tynse71864: 看更短時間就換 (6hr之類)
→ tynse71864: 另外你的細胞在 transfect後 4天才收… 他會長滿吧? (
→ tynse71864: ctrl組)
→ tynse71864: 其他 knock down可能本來就長不好 所以4天後還沒長滿
→ tynse71864: 才沒飄  (猜的啦)
→ nellnell: serum有沒有污染要等新的來了測試才知道 目前手邊沒有
→ nellnell: 那請問如果更短的時間換complete medium，建議多久呢?
→ nellnell: 怕太快就換的話DNA還沒進去細胞就被我換掉了
→ nellnell: HCT116根據經驗 繼代後放3-4天都是可以的
推 tynse71864: 我是說 serum free的 medium喔～
→ tynse71864: 我沒用過 k2,但一般 lipo建議6小時就換
推 tynse71864: 你以前送 gfp長的很好也是用一樣條件送的？
→ nellnell: 請問t大 你serum free是指哪一個步驟?
→ nellnell: transfect後換的是complete medium 我應該沒記錯吧QQ
→ nellnell: 是的 一樣條件 不過是不同次抽的GFP
※ 編輯: nellnell (1.160.31.104), 08/13/2016 12:48:02
推 tynse71864: dilute dna跟 K2 reagent用的 medium
→ nellnell: 了解 那我先試試看6小時換complete medium  謝謝~
推 tynse71864: 不同次 GFP有機率發生問題  還是要檢查看看 ? 如果
→ tynse71864: tf 1天後沒事，3天後有事 可能就是上面提的原因了～