[求救] Western求救！

[MLSHBen (酷喔)]

大家好

本板首Po，如有觸犯板規還是甚麼的請盡速通知謝謝

最近做Western老是有時候做得出來有時候又做不出來(明明是同一個sample)

做pull down的Western明明沒問題，跑細胞protein的Western卻老是出問題

困擾我很久所以想請問大家是不是我哪裡有出問題

原本跑出來是這樣http://imgur.com/nxJszRV

或這樣http://imgur.com/aY92h4A

Myogenin和FLAG算是有符合預期

但定量不怎麼對所以又跑了好幾次

但最近老是跑成像這樣http://imgur.com/tEqoZxd

想請問大家我是不是有哪裡出問題

流程列在下面了，想請大家幫我看一下，謝謝！

--------流程開始-------
收cell protein是用1x DPBS wash兩次後

加入RIPA buffer (含0.1% SDS, 1x protease inhibitor, 1x phosphotase inhibitor)後

用1000 μl的tip刮破細胞後收lysate，4℃   全速離心半小時後取上清液

測OD595算濃度後取50 μg(用二次水或RIPA buffer補到每個sample體積一樣)和4x sample buffer混合

92~95℃煮5分鐘後用100 V跑SDS-PAGE

Transfer是使用半乾式transfer

我Transfer前先讓PVDF membrane浸泡在methanol至少1分鐘、

厚片濾紙及gel浸泡在1x transfer buffer

先將濾紙放上正極板上，再依序放PVDF membrane、gel、濾紙疊上並擠掉氣泡 (多的transfer buffer用割stacking gel的那個綠色塑膠片塗平在正極板上)

用10 V, 200 mA跑1.5小時 (因為要transfer 2片gel所以用200 mA)

跑完後依marker將預期位置的PVDF割下來放入塑膠盒，

用5 % BSA (以1x TBST配置)進行blocking，室溫1小時

1小時後blocking倒掉先加5 % BSA，再加入一抗，4℃ o/n

隔天再拿出來室溫1小時 (學長說有的抗體還需要這步驟讓其binding更好還是啥的)

用1x TBST wash 3次，每次10分鐘

倒掉1x TBST後先加入1x TBST，再加二抗，室溫1小時

再用1x TBST wash 3~4次，每次10分鐘

PVDF放擦手紙上使其稍微乾一點後用配好的ECL反覆淋5次以上

放擦手紙上使其稍微乾一點後放到底片夾的透明膜裡去暗房壓片

-------流程結束-------

其實我個人猜想是不是transfer出問題，但問學長他不認為是transfer的問題

關於transfer另一位學長說只需要定電流即可(一片gel用90 mA for 2 hrs，兩片則電流加倍以此類推)，他說因為電壓會隨buffer加的量而有所不同

我只定電流幾乎做不出像上面第一張圖或第二張圖那樣 (但pull down我只定電流都沒問題，有觀察到只定電流電壓會升到10~15 V)

帶我做實驗的學長卻連電壓一起定，每次我都有觀察到電壓一到10 V後電流就開始往下掉，但他說電壓有到就好了，有時候這樣就做得出來

我看網路上教學影片還有看到把正極板上的buffer吸乾而不是像我們這樣塗平的，然後他是定電壓

想請問半乾式transfer到底哪個做法才對？

blocking用BSA或脫脂奶粉好像也沒影響

另外想請問抗體是否也可能影響結果？

像我問學長FLAG是否可用mouse monoclonal的FLAG一抗，他都叫我用rabbit polyclonal的FLAG一抗

雖然我覺得做不出來大概還是我技術的原因居多......
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附上buffer成分

10x running buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine, 10 g SDS,用二次水配成1L
1x running buffer就是將10x的用二次水10倍稀釋

10x transfer buffer:30.3 g Tris base, 144 g Glycine,用二次水配成1L
1x transfer buffer就是取50 ml 10x，加二次水到450 ml後再加50 ml methanol再混勻，平常存4℃

10x TBST:40 g NaCl, 12.1g Tris base, 5 ml Tween20,用二次水配成500 ml, pH 7.6
1x TBST就是將10x的用二次水10倍稀釋

4x sample buffer:10 ml的 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 1.6 g SDS, 8 ml 100% Glycerol, 80 mg Bromophenol blue, 1.6 ml β-me
平常存在-20，分裝1 ml，要用時將那1 ml放室溫等它融後再使用
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ps.做膠參照類似這張表http://imgur.com/IMtaj8x

做8 % gel跑FLAG，10 %跑Myogenin

如提供資訊不足請再通知

謝謝！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.103.200
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1472399550.A.C43.html
→ xxtomnyxx: 我覺得只是單純的因為 protein loading 過量或是抗體濃
→ xxtomnyxx: 我覺得只是單純的因為 protein loading 過量或是抗體濃
→ xxtomnyxx: 度太高
→ Ianthegood: 抗體絕對會影響結果 同一隻不同批號的都會不一樣了...
loading和抗體我每次都下一樣的量喔

順便想請問如果loading減半那transfer條件要改嗎？

謝謝！
※ 編輯: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 11:07:15
推 tynse71864: 如果是 sigma m2那隻 mAb ，WB超難用…
→ tynse71864: Rab 會好用很多 但 blocking跟一抗都建議5%牛奶
→ tynse71864: Rab 會好用很多 但 blocking跟一抗都建議5%牛奶
→ tynse71864: 還有第1&3圖連結失敗
推 tynse71864: 一般只會定電壓或電流一個吧 另外一個只是調最高上限
→ tynse71864: 而已？
想請問sigma那支難用的意思？因為我也有用成功過一次...那為什麼Rab會比較好用？

圖的話我用電腦都看得到，用App我反而是第二張看不到（如果有需要的話我等一下改一下）

謝謝！
※ 編輯: MLSHBen (140.112.121.239), 08/29/2016 15:05:16
→ tynse71864: 因為我用 M2訊號都很弱  改用 Gtx的 Rab pAb就超強 所
→ tynse71864: 以之後都用 polyclone的
→ blence: FlagM2用5% milk背景乾淨訊號弱,用1%可省Ab,訊號也正常了
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:16:44
→ blence: pull down跟lysate的WB有什麼不同？ 是IP或recombinant?
→ blence: 至於lysate,是因為測OD後跑出來不一致,所以又freeze-thaw
※ 編輯: MLSHBen (140.112.122.57), 08/29/2016 18:20:24
→ blence: 數次,是這樣才容易出現Flag-tag不好看的情況嗎？
圖有重弄一下可以幫我看一下這次看得到嗎？

pull down那個就是IP，不過現在跑的這個lysate一開始跑就像第三張圖那樣

是後來學長和我照我上面寫的流程重跑一次才得到第一張圖的結果

然後之後自己再做一兩次有得到第二張圖和第三張圖的結果
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:45:25
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 18:48:45
→ tynse71864: 但我試過2% 牛奶好像沒什麼差
推 tynse71864: 圖好了!
前面tynse71864大提到只能定電壓或電流其中一個，另一個是最高上限

那照我的流程就是一開始電流定在200 mA，當電壓到最高上限10 V時就變成定電壓的意思嗎？

所以問題可能會是在這邊嗎？

謝謝！
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:24:17
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:25:04
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:28:51
推 tynse71864: 就是看哪個先上升設定的值 那就會以那個值跑
→ tynse71864: 但如果是這樣 你看 marker就應該知道出事了
→ tynse71864: 上升到*
請問怎麼看marker來知道有沒有出事？是指marker的band變有一點點圓和厚嗎？
如果是這樣那該怎麼解決呢？
謝謝！

話說最近壓片明明沒壓多久(大概不到1分鐘吧)也會把marker給壓出來
所以也有想說會不會是blocking的問題導致第三張圖那樣？
※ 編輯: MLSHBen (140.112.130.149), 08/29/2016 20:54:55
推 ko363630: Gtx不是很爛嗎，那隻cell signal 沒有賣嗎
推 tz2733: sample有反覆解凍或保存過久之類嗎?覺得要從sample狀態跟
→ tz2733: 抗體(blocking 1 2抗濃度)去找解決方法
sample是上個月月初收的，保存在-80
反覆解凍大概五次左右
聽說實驗室學長的sample好像反覆解凍好幾次都還可以跑的樣子
難道跟RIPA buffer裡加的protease inhibitor有關？

先謝謝大家這麼熱情地幫我解惑！
由衷感謝！
※ 編輯: MLSHBen (36.229.234.9), 08/30/2016 02:53:33
推 tz2733: 5次有點多ㄟ...我收全細胞用不同的lysis bufffer  大概-20
→ tz2733: 解凍3次後跑出來的band就開始微微糊糊的...  給你參考
推 tynse71864: 我頂多跑2次 還要看你蛋白的穩定度;另外有些蛋白丟-80
→ tynse71864: 再解凍很容易降解
推 jsi: 你的WB做得不錯，技術應該沒有問題，贊同1F說的可能性，此外
→ jsi: 也可能是你的目標蛋白degrade所導致。y
推 sonny77: loading 50ug不會太多，覺得是反覆解凍的問題
→ sonny77: 我會配大約跑兩次的量，還需要就在解凍lysate重配