→ Invec: T5 exonuclease 會幫你吃 不用消化 08/30 13:32
→ Invec: 通常失敗原因都是linker太短 08/30 13:33
→ Ianthegood: 什麼是「連接不上」? 沒有colony還是false positive? 08/30 19:30
→ belle0625070: 是盤子上沒有菌落。 09/15 02:30
→ Ice9: 所以，你的 PCR 產物没有用 RE 去切？你只切了 vector？ 09/17 09:43
大家好，小女子最近新入行分子生物領域，請大家多多指教。最近嘗試Gibson 法來克隆，但都無法成功連接，想不出原因希望能夠跟大家緊急求救一下。
我的primer是由lab有經驗的學姊設計的，但是這次我更換了其中F鍊跟R鍊中的酵素辨識區塊，除了那六個鹼基其餘都保持一樣。使用F+L/R+U的反應分別完成兩管PCR。
Vector部分使用新設計的酵素切成線性，這個部份我確定應該沒有問題。
連接時候我的疑問是，手冊上面並沒有讀到提及PCR的產物需不需要用酵素消化，只說如果純度有90%以上是可以不需要純化的。意思是可以直接用PCR產物跟線性Vector連接嗎？
以上是我覺得可能的問題，如果有什麼描述不夠清楚的地方請告訴我我再補充。不好意思剛入門很多搞不清楚的地方，再請大家多多指教。感謝！
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