[求救] 用Oligo dT跟一Forward primer取代3' RACE

[kaofei (phoebe)]

大大們好：

想請問有人有用過oligo dT跟Sequence裡的forward primer去跑PCR

夾出用oligo dT轉出的cDNA(RNA有poly A tail)嗎

會這麼做是有點想避開3' RACE，而且實驗室有人有成功過(雖然是不同的RNA)

不知道有沒有經驗可以分享一下

我之前做常會遇到well很亮，但沒有band的情形

用了hot start

步驟大概是：

PCR mixture (GeneDirex HiFi系列) without polymerase 95度C 4 min後迅速放回冰上

再把polymerase加進去，然後on一般的program (initial denature, denature...)

結果well卡章的情形有好轉，目標band也慢慢出來了，只是亮度都很淡而且有雜band

所以就提高了annealing temperature(55-->60)，雜band有減少，但目標band還是不亮

因為實驗需要定序RNA的全長，這個片段需要被Clone出來

希望PCR product的量能多一點

不知道有沒有人有甚麼方法可以幫忙改善這個情形

或類似經驗可以分享的，謝謝！


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.96.149
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1472980634.A.6AB.html
※ 編輯: kaofei (140.112.96.149), 09/04/2016 17:17:54
推 jabari: RACE就多屁股的Anchor而已...多跑一圈乾淨很多
→ jabari: 況且你都用Hifi在跑了 多跑一次跑嘛跑嘛
推 Ianthegood: 推樓上XD
→ Ianthegood: 或是多換幾種polymerase跑啊 有時候便宜的才跑得出來
→ kaofei: 了解，所以不用擔心多跑一次序列可能出錯嗎?或者HiFi超威?
→ kaofei: 還是因為我要先切膠純化的關係@@"，這樣是不是會比較保險
→ Ianthegood: 只要你的error rate<10^-4 第一次做錯的在第二輪會被
→ Ianthegood: 稀釋到不見 就切正確的size多挑幾個clone定序囉
→ xxtomnyxx: 我想問問你為什麼會想避開 3' RACE ?
→ kaofei: 主要是如果這樣做得出來，就不用再多買個kit，單純經濟些
→ kaofei: 沒甚麼太厲害的理由其實XD"
→ xxtomnyxx: 咦？不是只要多訂一條帶有 adapter 的 dT primer 嗎？
推 jabari: 3'race不用kit...上網找manual, 定primer 就好
→ kaofei: XD" 了解，抱歉學藝不精，會再努力的，謝謝！
→ Ice9: 目標產物有多長？會不會有 isoforms?
→ kaofei: 大概1600 bp，isoform是指@@"...抱歉這部分還沒很了解orz
→ xxtomnyxx: 你去 NCBI 找你的目標基因(記得選對物種)點進去看，
→ xxtomnyxx: Genomic regions, transcripts, and products 欄位如果
→ xxtomnyxx: 你的基因有超過一條線，就是有 RNA isoform