[求救] 請問大家多用哪一家polymerase?

[aaaazzzz (找英文家教)]

想請問大家在construct基因的時候，

通常是用哪一家的牌子可以得到非常低的錯誤率?

最近在做一個約3K的基因，

要將其塞入pCMV-2A的質體，

花了快三周的時間確定整段序列正確(已經將整個CDS分四段定序完成)，

下一步做了八種不一樣的點突變，

原本只定序突變的位置，

(因為一次定序約800-1000bp，保守是600bp)

有同仁建議還是整段定序比較好(整段定序就要多花三倍的錢)

結果定序結果出來八個序列有三個出現各一到二個胺基酸(胺基酸真的改變)錯誤，

學理上可能不影響我的實驗結果，

但為了科學的真實性，

我還是又花了一周多的時間重作，

結果錯誤的三段裡面，

其中有二段基因還是錯誤，

而且錯的地方跟我第一次錯的地方不一樣，

因為定序是委託基龍..做的，

有爬過文，

看大家對他們的家的primers不大滿意，

所以我想是不是定序出現錯誤，

就在附近設計另一段倒回來的primer，

結果定序跟前一次相同(表示定序應該是OK的，訊號非常明確)

我使用的polymerase是NEB的Q5 DNA Polymerase，

業務跟我說是市場上最佳精確度，

比別家正確率高很多，

另外Pfu錯誤率為1/130,0000，

以我約3kb的大小，

錯誤率低於1/400，

但我這系列重組約14段(單一或數個點突變)，

其中有五段有問題，

出錯的機率也太高了！

不曉得各位版友，

大多使用哪家的Pfu來construct，

謝謝！

附註：我使用60度，30cycles，其他比例依照原廠(NEB)提供

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→ Bows: 你有看基米的定序圖嗎，有時候是他從pick轉文字會有錯
→ Bows: 我基米的定序有錯會再去對pick
→ aaaazzzz: 有看,波型很明確(沒有雜band,也不是很多的A or T or C
→ aaaazzzz: or G疊在一起,而且錯的地方離primer約3-400bp，所以也不
→ aaaazzzz: 是因為定序的尾巴或頭造成的錯誤(指訊號不穩定)
→ blence: 除非seq比較怪,我覺得不應該會有突變,另外錯誤率1/400不是
→ blence: 這樣算的
→ aaaazzzz: 回b大，我一開始也以為我原本突變的點成功就好了(那附近
→ aaaazzzz: 的序列也正確)但沒想到多訂頭尾之後,出現不同位置的錯誤
→ aaaazzzz: 有一次還由TCA出現TAA(stop codon，那當然要重做)的突變
→ aaaazzzz: 還有一般觀念說Taq錯誤率高，但沒想到我用了具有Pfu功能
→ aaaazzzz: 的polymerase，錯誤率也高得離譜，正準備向別家購買
→ blence: 你如果用site-direct方式做,30cycle也太多了
→ aaaazzzz: 沒錯，我是用site-directed mutagenesis，一開始先設計
→ aaaazzzz: 兩段部分互補的序列(包含我想要突變的部分),P了30cycles
→ aaaazzzz: 之後,兩段使用1:1當成模板,再用頭尾的primers,再P 30
→ aaaazzzz: cycles，所以b大建議我調低cycles數？但先前用25 cycles
→ aaaazzzz: 來P，看起來band很微弱
→ blence: 這樣難怪有突變出現  http://tinyurl.com/j5jhqv6
→ blence: 還有這個  http://tinyurl.com/ht27dg7
→ blence: 多了10cycle就1000倍了,你的長度又達3k,很難不會有突變
→ blence: 去增加template,或參考先前文章調整reaction或primer
→ xxtomnyxx: 就我所知，Q5是當今排名第二，第一是Platinum SuperFi
→ xxtomnyxx: ，Phusion排第三，不過SuperFi和Phusion都能 1kb/15s，
→ xxtomnyxx: 而且還有dsDNA binding能讓Tm提高，所以我比較推這兩個
→ xxtomnyxx: 然後我如果做template是plasmid的PCR，我都加已純化的
→ xxtomnyxx: plasmid 500 ng/ 100 uL PCR reagent然後跑25 cycles，
→ xxtomnyxx: primer也都下最高濃度F和R各 1 uM。
推 hitmd: 可與該區業務聯繫，請公司幫你抓問題點
→ aaaazzzz: 感謝b大與x大回覆，我再試試看25cycles效果如何