[求救] 抽RNA 加75%EtOH離心後無pellet

[tumourjoke (毒瘤)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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小弟用實驗室的protocol抽RNA 基本上是phenol-chforoform法

目前做到最後面幾步

等待清洗用的酒精揮發後將pellet用純水回溶 →

測定RNA濃度

由於 260/230大於2.5認為是酒精還沒乾就回溶 於是再加入75%EtOH 並且離心

打算重來一次清洗的步驟

到這邊還算正常 之前的RNA pellet存在且大小OK

結果離心完發現管子裏頭沒有pellet
大崩潰!!! 求助!!!




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.114.95.203
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1475838264.A.22B.html
→ a90648: 要補鹽類啦 不然無法沉澱出來
→ tumourjoke: 不是很懂要補鹽類的意思
推 huuban: 我們沒看到pellet都繼續做，溶下去就有了XD
→ huuban: 一樓應該是指要加十分之一體積的3M NaOAC?
→ a90648: 就是樓上說的!! 可以另外去估狗LiCl
→ sunorange: 我們都加 glycogen 。比較不會影響後續的實驗
實驗室用的protocol裏頭有一步驟即是加上1/10體積的NaOAc
不過教導實驗的助理沒有說明過原理 感謝各位的信息提供!!
※ 編輯: tumourjoke (140.114.95.203), 10/07/2016 23:23:37
推 darrenyo: 借串請問一下 TRIZOL抽的protocol中 倒掉isopropanol後
→ darrenyo: 就直接加75%EtOH 不用補鹽類的原因是?
→ sunorange: 其實步驟中有提到 ，細胞或是組織少的時候 。可以加NaO
→ sunorange: AC，幫助沈澱
推 Ianthegood: etoh>70%+高鹽 鹽會把水搶走 讓核酸沈澱 glycogen只是
→ Ianthegood: 稀釋體積比較好pipet
→ Ianthegood: isopropanol後的沈澱本身就很多鹽 70%etoh反而是要把
→ Ianthegood: 太多的鹽洗掉
推 ararthur: 260/230>2.5是酒精沒乾就回溶? 哪裡查到的阿?
→ ararthur: 核酸溶解度:低鹽>高鹽;70%EtOH>100%EtOH>H2O 把握這原則
→ ararthur: 即可 至於glycogen和linear acrylamide則是替小片段核酸
→ ararthur: 和少量核酸增加沉澱機會而已 例如tRNA或oligo等等 所以
→ ararthur: 坦若本來就沉澱得出來 加此兩項 意義不大
→ ararthur: 另外上面提到LiCl 有人說不適合小片段RNA 並可能抑制RT
→ ararthur: 所以請斟酌使用
→ WinnieDad: RNA和DNA所須使用的phenol pH值也不同，要注意。