[求救] 小鼠腸道組織研磨

[tynse71864 (TATA box)]

版友們晚安


最近要將小鼠的小腸上皮細胞 (IEC) 做均質化

之後要上超高速離心 分出ER與Golgi

然而最近卡在細胞無法打破的窘境

幾乎8~9成的protein都在unbroken pellet中

因此來求救


均質方法:

IEC先以swelling bfr [10mM HEPES +1xPI (protease inh)] 5min

再加入2x的homogenize buffer (10mM HEPES, 150mM sucrose, 0.5mM DTT, 1x PI)

此處我試過用Tight Dounce homogenizer 30次或是30G 針頭 30次

磨碎後離心 分出pellet 與sup

再取相同比例做western blot

(以Calnexin做ER marker/GM130為golgi marker)

大部分蛋白都在pellet中  並沒有被打破



[有以Huh7 cell line 當作技術練習

 一樣的方法下 大部分的蛋白都會跑去sup  留在pellet的很少]



希望有類似實驗的版友們能提供些建議了 謝謝!



PS:  有找過paper 會使用nitrogen cavitation bomb來破細胞

但周遭的實驗室都沒有這個儀器...  想請問有人使用過嗎?

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.228.136.225
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1476370801.A.EBD.html
→ sunorange: 可以先用液態氮磨過再抽
怕LN會把我要看的胞器都爆開了...
※ 編輯: tynse71864 (36.228.136.225), 10/14/2016 22:36:00
→ signo: 舉手.要不要試著將脹破細胞的時間延長?另,離心轉速不行太高
推 hypocrisyha: 不好意思請問樓上轉速大概要多少呢？(剛好也遇到同
→ hypocrisyha: 樣問題QQ
→ signo: 用過500g來分未破的細胞+核,但分的目標不同,buffer也不同..
→ tynse71864: 我以為這篇沒人回了@@  我猜那個10k*rpm是要快速把細
→ tynse71864: 胞離下來 (怕低速時間太久會破太嚴重
→ tynse71864: 我後來試過10-15分鐘  (看起來)沒問題  15之後我的 gr
→ tynse71864: adient分層會開始模糊