[求救] NHEJ assay 原理看不太懂

[nellnell (小厚)]

大家好

小弟最近在讀一篇paper  上面有做了NHEJ assay

大概就是說某個基因會加速NHEJ 把那個基因抑制之後發現細胞colony變少

做法是使用兩組細胞 一組control 一組siXXXX (那個基因)

然後另外使用G418去篩選 最後觀察到有G418 也有siXXXX的細胞 colony最少

原文是這樣說 :
Cells were transfected with a linearized vector

harboring a neomycin-resistant gene and an siRNA targeting XXXX (基因)

In the presence of neomycin, only cells that can

integrate the plasmid via NHEJ survive

所以我又去查了他transfect什麼plasmid

結果是這個 : BamHI-XhoI linearized pEGFP-C1

我不懂的是 這個plasmid看起來就是表現GFP 那他要怎麼篩出

只經由NHEJ存活下來的細胞?


不知道有沒有做過這個實驗的學長姊

我看好久還是不太懂

麻煩各位解惑了!!

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→ blence: 你看一下pEGFP-C1的map,應該有標著Neo resistant
→ nellnell: 嗯嗯我有看到 但是不懂和NHEJ有什麼關係
→ nellnell: 應該說 沒有那個plasmid的細胞會被G418殺死 但是剩下有p
→ nellnell: lasmid的細胞為什麼就和NHEJ有關
→ xxtomnyxx: http://bit.ly/2dWacqC
→ xxtomnyxx: "Vector considerations" 裡有寫，linear 的 vector 在
→ xxtomnyxx: 細胞中沒辦法維持太久，所以如果細胞沒有靠 NHEJ 把它
→ xxtomnyxx: 修補回 circular，這個 vector 就會很快被降解掉。
→ xxtomnyxx: 所以用 G418 下去篩活的下來的都是 NHEJ 能力好的細胞
→ xxtomnyxx:                     得
→ blence: 實驗設計B-Xcut應該是為了不想直接接成circular,而且就算
→ blence: 是接成circular,naked plasmid也大概只能保留一週就降解掉
→ blence: 所以應該不是上面說的
→ blence: 這plasmid目的還是genome integration為主;一般要嘛以同源
→ blence: 互換,或非同源嵌入(NHEJ),所以G418是要篩出有進到genome
→ blence: 的細胞,因為pEGFP沒也設計同源序列,所以推論透過NHEJ機制
→ blence: 不過這個不是良好的NEHJ assay
→ nellnell: 後來看一些資訊 似乎是有用限制酶去切plasmid 如果NHEJ
→ nellnell: 活躍的話會把plasmid重新接上 才不會被G418殺ㄙ
→ nellnell:     死