[討論] 如何得知膜蛋白在何處被磷酸化修飾？

[gustpigex (鼻子好像灌太多了)]

如題，最近想設計實驗探討膜蛋白是在胞內被磷酸化或是運送到細胞膜後才被磷酸化。
請問各位有人看過相關的文章嗎或做過相關的實驗嗎？

目前想到的方法是使用exocytosis inhibitors,再用磷酸化抗體做IF實驗觀察。 但總覺得使用抑制劑不太好
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.136.13.182
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1477496404.A.3C6.html
→ e104582001: 萃膜蛋白&質蛋白做WB?
→ e104582001: 膜蛋白中的phos比例較質蛋白增加→在膜上磷酸化?
這樣好像還是不能確認磷酸化的位置@@
→ e104582001: 仔細想想似乎不行
推 darrenyo: 直接用IF看在胞內有沒有磷酸化蛋白?
有試過了，染到的都在細胞膜上，想到的原因可能是磷酸化後會馬上被送到膜上。
※ 編輯: gustpigex (223.136.13.182), 10/26/2016 23:58:03
※ 編輯: gustpigex (223.136.13.182), 10/26/2016 23:59:51
→ blence: 拿掉signal peptide或接個GFP或N-ter tag,那它不上膜？
以前學長有做過接GFP,會影響蛋白的運輸，會不會上膜我要再問問他。說不定可以試試看
※ 編輯: gustpigex (61.228.33.252), 10/27/2016 00:29:59
→ xxtomnyxx: 你的蛋白是哪種膜蛋白？transmembrane 還是 GPI？
磷酸化位點在cysosol，蛋白質C-terminus的位置
→ xxtomnyxx: transmembrane 的話是哪種 type?
為6次穿膜的膜蛋白，N,C端皆位於cytosol
※ 編輯: gustpigex (223.140.138.61), 10/27/2016 13:33:05
→ xxtomnyxx: 那磷酸化的胺基酸在細胞內還是細胞外？
※ 編輯: gustpigex (223.140.138.61), 10/27/2016 13:35:47
→ xxtomnyxx: 那我會試試加 KKXX 讓它 retain 在 ER 再看是否會磷酸
推 tynse71864: 想請問不想用抑制劑的考量是什麼?
推 GG810424: 做phosphoproteomics,用Mass去測蛋白上的PTM