[求救] Aβ peptide western blot

[Bows (包斯 一兵 >>)]

在下最近在做有關阿茲海默症的研究

需要以 Western blot 去看Aβ(β-amyloid, 4.5kDa) 及其聚合物在 model 中的表現量

此 model 經 ELISA 以及 IHC 偵測後確認有 Aβ 的表現

但以 western blot 去壓，則是完全無法看到 band

以下是 protocol

Gel: 15% tris-tricine gel

Runnung buffer:
               Cathode (1L):Tris-base 12.1g
                           Tricine 17.9g
                           SDS 1g
                           pH 8.8
               Anode (1L): 0.2M Tris-base pH 8.8

跑完膠後以160mA/1hr (以調整過時間，再減少會轉不上membrane)
以全濕式轉漬 transfer 至 0.22μm PVDF

Transfer buffer (1L):
                Tris-base 3g
                Glycine 14.4g
                MeOH 200 ml

Transfer 後以5%脫脂奶粉 blocking

後以 6E10 antibody 1:1000 hybrid overnight

以TBST wash 20 min/3 times

再以2抗 1:5000 hybrid 1hr

後 TBST wash 20 min/3 times

接著ECL顯影，結果均看不到12kDa以下的band 如圖http://imgur.com/tc89Lpj

也有切開hybrid過亦看不到訊號，目前推測是在樣品前處理 (RIPA buffer)中未加PMSF

請問這過程有什麼需要注意的問題嗎?


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推 tynse71864: 可能就是 lysis時 degrade光了吧   另外 transfer buf
→ tynse71864: fer建議不要 reuse(在這個實驗裡)
→ tynse71864: MeOH比例下降會讓小分子較易飄走
推 tynse71864: 還有你的 Mr只有10  確定4.5沒跳海嗎？ (雖然我覺得15
→ tynse71864: %tricine gel應該是沒問題
→ Bows: 我們的transfer buffer都沒有在 reuse 的，會覺得是degree
→ Bows: 的原因其實是有在跑 abeta peptide 在右邊下面有很淡的band
→ Bows: *degrade
推 elelith: 如果要重跑 建議用有2KD的MK monomer dimer 都小於10
→ elelith: 就算elisa和IHC有 WB也有可能訊號不夠強壓不出來
→ Bows: 我其實有用 2kDa 的marker 去跑，只是手邊圖看不清楚，很容
→ Bows: 易飄掉