[求救] 請問關於plasmid construction注意事項

[smallmin (小明)]

小弟我不算分生新手
該知道的基本操作步驟都知道
碩士期間開始接觸plasmid construct
剛開始做初期成功率也有60%
後來當了三年多助理
construct plasmid成了一個很基本的技術
挑的clone成功率90%以上很正常
幾乎沒有重做三次內做不出來的construct

我這一年多來換工作後
construct非常不順利
連TA cloning成功率也很低
常見的狀況是

transform隔天single colony很多 常常破百
可是
用restriction enzyme切 大小總是不符預期
重做5次 挑了50個colony
90%的pattern都一樣
切出來pattern可以再現 但都不對
ex: 我預期切出來是3.1 kb + 1.0 kb
可是切出來90%都是3.5 kb + 0.6 kb

甚至發生總大小比預期大的狀況
ex: 預期plasmid最後是7.3 kb
卻看到7.0 kb + 1.5 kb
定序結果都不對

或者enzyme切出來不對
colony PCR結果 90%的clone band卻正確
可是定序一樣不對

因為我不是新手 碩士畢業 又有三年多實驗室助理經驗
這種基本實驗卻一直失敗
過去一年來construct成功率只有一成左右
可是我同事們都很順利
很少發生重做三次內沒成功的狀況
讓我壓力很大

我跟主管 同事請教過
試過很多方法
https://www.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning
這類troubleshooting的資料也看不少

譬如ligation 加PEG3350 (final concentration 7.5%)
用commercial competent cell, RecA1 (抑制DNA recombination)
http://download.rbcbioscience.com/HIT%20Competent%20Cells/Competent%20Cells/HIT-21/HIT-DM.pdf
我是用HIT-DH5alpha
一年過去了 還是沒什麼改善
進度緩慢 壓力很大

歸納常見狀況
1. 轉型順利 single colony很多 常破百
但enzyme切出來結果不對
2. 我用只有insert上才有 vector沒有的切位
enzyme可以切出band 推測insert有接進去 但大小不對

想請教各位是否可以給我什麼建議
提醒我其他該注意的細節
謝謝

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※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1478174756.A.B75.html
→ xxtomnyxx: 操作時多做一管不加 DNA，看看塗盤會不會長。
→ xxtomnyxx: 然後你送定序得到的序錯的，所以那個錯的序列是從哪來
→ xxtomnyxx: 的？
→ xxtomnyxx: 然後，把你的 vector 整個都定序一次吧，也許 vector
→ xxtomnyxx: 的 map 序列根本是錯的。
→ blence: 新人可能不太好質疑plasmid要重訂序,私下可先用不同RE檢查
→ smallmin: 感謝各位的意見 我回覆一下 我用P insert的primer定序
→ smallmin: 基龍米克斯回覆 常常是 嚴重雜訊 或者primer bind不上去
→ smallmin: 最扯的是 我們實驗室沒人做老鼠實驗 碰相關DNA序列 有一
→ smallmin: 次定序結果正常 我blast卻是老鼠dendritic cell 相似度
→ schmitt: 我個人認為insert primer 定序，雜菌可能混在裡面
→ smallmin: 100% 我完全不知道該怎麼解釋
→ smallmin: 我是用kit抽plasmid 純化insert和vector ligation前也會
→ smallmin: 先跑電泳確認insert和vector大小正確 但因為結果實在很
→ schmitt: vector 自己要從新定序check，一樣是怕空的或是有雜菌
→ smallmin: 怪 我也懷疑是汙染 可是其他人用同一盒kit都沒問題
→ smallmin: 原本想附上連結 但網址太長 縮網址又不能推文 我查到一
→ smallmin: 個方法 挑colony 用無菌水或培養基suspend 塗在plate上
→ smallmin: overnight後 洗下plate上的菌 抽plasmid 可以避免
→ smallmin: rearrangement 感謝大家提供的意見
→ smallmin: 我測試一下 如果有效的話再回報大家參考
→ storm780121: 是lentivirus相關的載體嗎?
→ smallmin: 應該不是 我用pGEX和pQE系列的vector都遇到同樣的狀況
→ smallmin: 我測試養plate 25度和37度 用無菌水洗下菌 抽plasmid
→ smallmin: 和20度液態培養 抽出來plasmid跟37度液態培養一樣