[求救] western blot 偵測不到大量表現的蛋白

[treelove (Jörg)]

大家好 想請問下

我用35S-promoter 大量表現一個transcription factor, 在Arabidopsis上建立

transgentic lines,在RNA上用RT-PCR 和q-PCR測是有

比wild type大量表現 (從10-50倍都有), 問題出在要用western blot 測protein

level時, 一直做不出來 (有放positive control有成功所以操作技術沒問題 ),

目前猜測是量太少,想請問除了用Immunoprecipitation外還有沒有其他方法去偵測?

又,有沒有甚麼方法可以證明這些protein是沒有功能的

(因為phenotype幾乎沒有, 我懷疑這些protein沒被製造出或是可能沒功能)

可以給個關鍵字讓小弟有點頭緒嗎?

(因為急著要在2個禮拜內趕出來)

謝謝各位~

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.248.180
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1478272547.A.6D1.html
→ e104582001: 是什麼 protein 很重要，盲猜很難，也不知道你WB是否
→ e104582001: 步驟有問題
→ e104582001: 某些蛋白質只能用固定的步驟去跑
 是transcription factor
[1;37m推 tynse71864: 是什麼蛋白 (？)  有可能你送的細胞就是無法協助此蛋   11/05 00:35
→ tynse71864: 白的產生   試試看外送到一般會表現此蛋白的細胞？
→ tynse71864: 我之前也做過 cell line怎麼外送就是沒結果  老鼠直接
→ tynse71864: 收一大團的蛋白
→ tynse71864: 如果是我說的情形  找找看是否製造此蛋白需要別的蛋白
→ tynse71864: 幫忙 ；同時外送也可以解決
→ tynse71864: 至於“沒有功能”這句怪怪的  既然都沒有表達了  何來
→ tynse71864: 功能之有
 就...在猜為甚麼detect不到的原因, 會不會是protein level出問題XD

→ lail: 用什麼系統表現？收蛋白質的時候確定有收到該蛋白質？有RNA
→ lail: 不代表有蛋白質，看功能就做functional asssy，然後就看該蛋
→ lail: 白質有什麼功能就去測試吧
是transgentic line, 萃取植株中的protein, 有在PVDF上用染protein的顯色劑去確認
有protein存在PVDF上
※ 編輯: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:44:41
※ 編輯: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:45:41
※ 編輯: treelove (140.112.248.180), 11/05/2016 08:48:06
推 lucifer74: 用更好的抗體、ECL、機器，換tag
推 lucifer74: 改用inducible promoter、35S的多篩一些independent li
→ lucifer74: ne
→ lucifer74: 用大量組織，濃縮核蛋白再跑WB
推 tynse71864: tx factor應該在核內？ 收蛋白的條件應該可破？