[求救] his protein western blotting 相關問題

[xenograft (努力嘗試學以致用中)]

想請問表現His tag的膜蛋白是否需要純化才能以western blotting的方式偵測到?

我們的實驗在膜蛋白上接有His tag，將其transfect into 293T cell，收細胞以RIPA ly
sis cell，而後lysate直接跑PAGE，再進行western blotting

此外細胞同時還有抽DNA確認transfection成功，抽RNA確認該蛋白mRNA有表現，同時也有
染FA確認該蛋白表現(anti-His)，以上三個實驗結果都確認該蛋白的確有表現

然而我們執行western blotting的結果卻是什麼都無法得到，二抗很明顯都認到背景，在
預期的位置完全沒有東西...

由染色結果來看，此蛋白表現強度還可以不過transfection效率不好，大概僅有5%，因此
想請問是因為transfection效率低導致無法染到，還是His tag蛋白本身就需要先純化才
能進行western blotting?

在此先謝謝各位了


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推 darrenyo: 有positive嗎？沒有his tag的western有做出來嗎
→ xenograft: 沒有his tag的western做的出來
推 lail: 理論上不用
→ lail: 另外293T應該轉染率很高，你可能要想辦法提高轉染率
推 lycantrope: transfection效率太低 target protein太少
→ enjorus: 293T只有5%，這個很怪。然後另個可以調整的是Western
→ enjorus: 部份，有沒有可能蛋白質都沒下來卡在well之類的。
→ enjorus: 因為我不知道你的膜蛋白分子量多大
推 DKKing: 有positive control嗎？抗體之前有成功過的data嗎？如果沒
→ DKKing: 有，可能是抗體出問題吧！
推 GG810424: 直接認His tag 後面的蛋白
→ GG810424: His tag antibody 在抗體市場目前很少有好的抗體
→ GG810424: 我有用過不錯的his antibody ，要的話可以借你試試，不
→ GG810424: 過我在中研院
推 GG810424: His purification 可以用Qiagen 的Ni-NTA agarose beads
→ xenograft: 謝謝大家，後來找到問題了，的確是抗體結合力不好，一
→ xenograft: 抗改成放4度overnight就成功了