[求救] mtt細胞存活率

[cowmama311 (牛媽媽)]

各位大家好，我的實驗是利用牛耳朵細胞來做實驗，是利用荷蘭牛跟黃牛的耳朵，做熱處理再利用mtt來測存活率。
實驗的步驟是，細胞解凍後24小時就繼代，待細胞養到八九成滿後，接種到96well分別做兩種濃度 一個是十的五次方  一個是十的六次方
每孔加100ul，分三組
分別為控制組、熱處理12h、熱處理24h。
熱處理培養箱溫度為42.5 7%co2
同一時間接種完後先放38.5度 5%co2培養
培養24小時後先將熱處理24h移入熱處理培養箱
36小時候後將12h熱處理組移入熱處理培養箱
而控制組則是一直都在38.5度培養箱中。
熱處理完後倒掉培養液
三組於同一時間加mtt藥劑（1mg/L）每孔加50ul，放回38.5培養箱3小時，再取出倒掉mtt 藥劑在加入50ulDMSO搖晃10分鐘，在去測od值

可是測出來的存活率都是熱處理比控制組存活率來得高，問了老師老師只說是我們自己的問題，因為方法是學姐教我們的，我們也做了五六次了，數據出來都是這樣，也請學姐從頭到尾看一次我們實驗，也沒找出什麼問題，可是數據就一直都不能用…………懇請各位大大們幫幫我吧…
一直失敗感覺超級失落。。。。

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→ raiyu: 那你用顯微鏡看實驗組細胞也比較多嗎?
→ raiyu: 實驗組的溫度會不會影響粒線體的活性? 所以影響MTT結果
今天看過了  處理組跟控制組細胞看起來一樣多 哭
→ Bows: 用手(計數器)算算看，若結果相同就是你們老師該去處理的事了
→ Bows: 不是所有實驗都會如預想的結果一樣
→ Bows: 若老師執意覺得是學生問題，那就塊陶阿
你說接種在96well裡頭做完處理後再把細胞打起來算細胞數？
→ Bows: 除非有之前人有做過預期的結果
之前學長用tunel跑flow有跑出有差異  可是現在我們用mtt測就一直做不出來....
推 tynse71864: 同 B大，後面學生推翻以前實驗室的結果不算不常見，尤
→ tynse71864: 其當先前條件不 detail時
推 tynse71864: 想問一下，有做 blank組嗎 (完全沒細胞的)
沒有耶  都是sample直接測
推 satantaco: MTT因為跟粒線體有關 所以會有假陽性的可能 要排除
→ satantaco: 必要時可能還是要計算數量來比對  或者再做LDH來互相比
再試這最後一次  希望老師會死心
大大還有推什麼比較簡單可以測存活率的方式嗎？
→ satantaco: 照  才會精準
→ raiyu: 測細胞存活率還有其他的實驗方法
有努力想讓老師換別種方式
→ cowmama311: 感謝各位  目前老師還是想嘗試  他有更改一些試驗方式
→ cowmama311:   增加三個控制組  分別為接種完24 36 48小時測   就
→ cowmama311: 讓他弄最後一次吧  有跟別的老師討論過   外系老師想
→ cowmama311: 法跟大家一樣  認為換個方法去測比比較好  但是我老師
→ cowmama311: 執意要我再測一次  只好陪他試這最後一次吧
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:55:45
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:56:56
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:58:59
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※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 16:59:54
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/13/2017 17:01:05
→ blence: 細胞剛解凍,MT活性還沒回來,測MTT可能沒變化
→ blence: per 96well可以放十萬,百萬顆?   牛耳朵細胞非常小顆嗎
→ blence: 細胞多,final MTT濃度卻比常用的少幾百倍,以前都這樣做?
→ blence: DMSO 50ul在96well在shaker應該搖不均勻,是用reader振的?
方法是學姐教的  這也是我一第一次做
因為學姐用豬耳朵細胞做有最出來
所以老師要我們也試試
關於要種的細胞數量  在下一次實驗我會試試種10000顆的看看

震盪的話使用這個http://i.imgur.com/7L01yNI.jpg
→ blence: 加MTT前是不是該讓各組細胞都回到同溫,反應效率才一致?
→ raiyu: 另外 感覺你的細胞種得有點多+1 96well一般癌細胞我最多種
→ raiyu: 1萬顆/well 做24hr 有時候細胞太多 生存條件不佳也有可能造
→ raiyu: 成細胞死掉
→ raiyu: (對實驗設計小小建議) 2組的溫度差其實不大 培養箱溫度並不
→ raiyu: 是這麼準喔
推 darrenyo: 最多10000 +1
推 cyuchien: 總共要養3天。會不會像樓樓上說的，控制組細胞太多有些
→ cyuchien: 爆掉了。
推 aaa111bb2: 怎麼不做positive control?
？？？？
→ e104582001: 96 well 1000000顆 太多了啦，20000~100000基本上多
→ e104582001: 樹細胞都會太滿了
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:25:16
※ 編輯: cowmama311 (118.233.44.232), 01/15/2017 23:26:37