Re: [求救] his-tag純化蛋白

[Ianthegood (雜碎。)]

   不完全相關,

   小弟最近也在做protein expression,

   多看了很多文獻有發現一些很奇妙的變因：

   假設菌跟plasmid都對的話,

   首先[IPTG]的範圍大概會從0.01mM~1mM都有可能是有效範圍

   我之前的protein在0.05mM的時候表現得最好

   再來OD

   建議做小規模0.3, 0.5, 0.8三個OD點的induction測試, 有時候菌就是在

   某個stage比較喜歡表現某個蛋白

   第三溫度

   長時間低溫, 短時間低溫, 長時間高溫, etc

   第四culture size跟搖晃速度

   這裡就開始很玄了

   有時候小管的表現很好, 放大到半公升一公升就怎麼都沒有overexpression

   如果你是很有動力的科學家, 你就會開始慢慢找變因

   如果你是工程師, 你就會set up 50管小管的

   然後也有聽過induction開始後降速到90rpm結果表現量翻倍的


   最後題外話, 如果蛋白怎麼樣都表現不出來怎麼辦?

   可以考慮換host(e coli strain), codon optimisation, fusion partner等策略

   真的再不行, 就換yeast或baculovirus吧XD



※ 引述《s992003 (Lord of Ethanol)》之銘言：
: ※ 引述《huangsw (Orz)》之銘言：
: : 43
: : 前人種樹後人乘涼, 但是難免有種歪的時候, 導致後人被壓傷, 這在科科界時有所聞.
: : 另外, 操作的手法也有可能會造成差異.
: : https://goo.gl/zMzalH
: : 請看上面這張圖, 理想的induction(中文應該是誘導?),
: : 應該要可以達到這張圖Lane 1 2的樣子(未純化).
: : induction本身牽扯到細菌的生長與複製, 意味著可以改的地方也有很多.
: : 不僅僅是IPTG和OD=0.5~0.6這兩個條件而已, 其實溫度也可以改.
: : 但是在做這些事情之前, 我覺得還是要先確認一下這個菌株仍有大量表達的潛力.
: : 如果沒有, 又想把事情做好的話. 那就砍掉重練.
: : 先把現在BL21的plasmid抽出來, 定序一下, 確保nucleotide是正確的.
: : (如果你找的到DH5alpha的菌株也行, 通常都用這個保存plasmid)
: : 然後重新tranform(轉形)到DH5alpha與BL21 並且妥善保存.
: : BL21的部分, 從transform的塗盤中, 挑選數個候選人(candidate)進行表現量的測試.
: : 挑到產量好的, 再去做induction的測試 (搞不好這時候就不用做條件的修改了).
: : 先確認有大量表現, 版友才好繼續幫你抓藥.
: : 如果有不懂的地方, 多看看paper也許會看到有用的資訊.
: : Good luck.
: 謝謝大大們的建議，我已經開始進行有無induction的比較
: 我的認知是如果要增加表現量就是增加induction時間,IPTG濃度,表現溫度
: 其他條件的改變(譬如低溫長時間表現)只是要避免inclusion body的產生
: 不知道這個想法是不是錯的
: plasmid的序列之前已經定過所以沒問題
: 然後BL-21挑表現較好的菌這步驟學姊做過，我目前是拿他挑的菌來用(約一年多前，都冰-80)
: 取菌方式是用tip沾一點丟入LB，保存的菌瞬間冰回去
: 還是其實菌並不能保存這麼久?
: 不過不管怎樣如果測試結果真的是無法大量表現
: 小弟會聽從建議打掉重練

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→ xxtomnyxx: 工程師XDDDDDD
→ Ianthegood: solve the question vs the problem
推 huangsw: 真核成本不低阿XDDD
推 tynse71864: 小管真的表現比較好 (哭
推 KittyGod: 放大養一般來說要先養小-->中-->大效果才OK
→ KittyGod: 太少量直接丟大瓶養不見得好
→ Ianthegood: 對啊 但有時候少量放大也表現不好 就像我今天的實驗=
→ Ianthegood:  =
推 s992003: 謝謝大家 獲益良多！生科的實驗感覺也很不容易啊 為啥在
→ s992003: 台灣都ㄎㄎ
→ xxtomnyxx: 樓上那是臺灣體制的問題，這問題也因而造就了ㄎㄎ的學
→ xxtomnyxx: 生....
推 abcm1042: 放大後也要看搖的方式跟個人手法