[討論] Real-time PCR的電泳產物

[bbbnick (Nick)]

有個實驗問題想要請教一下版友~

最近做一些以Real-time PCR的同一類型的成分分析 (以Kit驗)

結果:
1. Inhibition全部皆無抑制現像 (正常，Ct值無異常)
2. Reaction中NTC、NC如預期沒有訊號(X)，PC有訊號(O)，待測物無訊號(X)

一時興起將產物拿去跑電泳，

結果:NTC、NC無任何條帶，PC、待測物在同一個位置皆有一個乾淨的放大產物(~約150bps)

如果今天Real-time PCR有任何問題，Inhibition皆無任何抑制現像，且PC有明顯訊號

可是電泳結果又很奇怪，PC及待測物有單一產物，但待測物於real-time PCR無訊號

請問何解?  @@

PS: 將該待測物拿去驗ELISA有檢出蛋白質。 (表示含該成分相關蛋白質)

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 211.75.95.2
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1487146793.A.B62.html
→ Ianthegood: 待測物是什麼
待測物是食品樣本，要鑑定裡面的成分
→ a90648: 待測物膠的band跟PC比強弱如何? melting curve有訊號嗎?
kit的PC強度較待測物弱很多，但還是看得到清楚的band，
方法是probe-based real-time PCR
推 jabari: 定序啊
今天將PCR產物送定序了 XD
→ lail: 你是用probe還是SYBR?再設計一對primer?
Probe-based real-time PCR喔!
因為kit是commercial kit，無法得知用的primer序列，
而且也不知道針對標的物的哪段基因，只知道針對該成分的ITS1基因
※ 編輯: bbbnick (114.39.176.167), 02/15/2017 23:54:54
→ lail: 可以自己設計，自己合primer，不算貴
→ lail: 有軟體可以用，我覺得roche的系統都不錯
推 Ianthegood: 一個lane跑沒跑pcr 純的待測物看看
→ a90648: 看來待測物的量應該不少，會不是會訊號太強被濾掉了?
→ a90648: 我曾經遇過ct只有2~3，roche nano軟體直接濾掉沒data
→ a90648: 後來調了exclude early cycle的值data就出來了
→ a90648: 不過挼果真是這種情狀我會建議dilute DNA後再跑一次
→ a90648: 不過我是用SYBR 不確定probe system會不會有太強的問題
謝謝您的建議，今天試了稀釋兩個稀釋倍率，Ct值與NTC、NC一樣仍然是沒有訊號Orz...
看來我先等定序的結果好了~
※ 編輯: bbbnick (211.75.95.2), 02/16/2017 16:33:45
→ a90648: 如果是這樣的話感覺是primer P到的不是probe bind的地方
→ a90648: 那定序出來應該PC和待測物結果會不一樣
可是電泳結果PC、待測物的擴增產物size一樣 XD  怪怪的
就等定序出來再看看~ 謝謝囉!
※ 編輯: bbbnick (211.75.95.2), 02/17/2017 14:39:46
推 aaaazzzz: 請問定序結果如何？應該出來了吧，我也很好奇
→ bbbnick: 還沒耶 XD
→ bbbnick: 定序出來了，PC與Sample一樣，不知道為什麼沒訊號@@
→ a90648: 有qPCR signal的圖和膠圖嗎?
→ bbbnick: 膠圖: http://imgur.com/a/w1uQT
→ bbbnick: qPCR圖: http://imgur.com/a/UJTJm
→ bbbnick: REF是同類型的參考物質 (理論上與PC同)
→ a90648: 圖看起來頗正常的阿@@  還是改用SYBR試試?
→ bbbnick: a大謝謝您喔! 我有機會再試試看 @@
推 cobraho: 好奇定序結果XD
定序結果出來了喔
REF(參考物質)與待測物序列相似度99% (只有中間幾個鹼基不同)
推 ararthur: kit放多久了 我推測是probe壞了 從qPCR amp plot看curve
Kit還有半年效期，且Kit的PC沒問題 @@
→ ararthur: 理論上pc/sample應該是要跟ref平行比較合理吧
→ ararthur: 不過也可能是根本P出奇怪的片段 即使跑出來band一樣 但
→ ararthur: 主要amplified產物並不是目標產物 所以probe可能hy得到
→ ararthur: PC/ref 卻hy不到samples 可以試著用那組primer配sybr
→ ararthur: green跑看看 然後看melting curve 是否產物Tm不同
→ ararthur: sequence出來 PC和sample一樣都沒訊號 很可能就是主產物
→ ararthur: 根本不是你想要amplify的片段
有機會會用SYBR試試...
→ a90648: 他有說sequence結果是一樣的東西了
※ 編輯: bbbnick (220.130.231.117), 03/01/2017 09:31:13
→ a90648: 會不會就是因為中間那幾個鹼基是probe binding site
→ a90648: 所以導致待測物沒訊號?
推 Ianthegood: 不是吧 taqman做在3'端 貼不上去就沒訊號不是?
推 Ianthegood: 搞不好你的well掛了XD 換個well跑跑看