[求救] PCR 結果一直不理想或沒東西

[taya1991 (請叫我雞頭!)]

各問前被大大們好

目前被交代要做Genome typing

事情是這樣的，LAB中有2批小鼠的染色體上，分別帶有人類某A或某B gene的DNA
→cDNA的形式(沒intron)，而且是homozygous
也就是A這批小鼠身上某條染色體上帶了A gene
      B這批帶了B gene

-------------------------當然，這是廠商給的訊息--------------------------

那麼我現在要用PCR的方式去放大這個A gene 或B gene
由於A B兩者相似度很高
所以在抽出老鼠的genomic DNA之後，跑PCR要送sanger定序

問題來了，設計的primer包含reverse 和forward都有確定可以夾到這兩個gene
但PCR出來的結果(2% agarose)，要不看不到東西，就是不亮
※我有夾這個gene的plasmid作為確認產物大小的control


     A B gene大概長這樣 → 111111111111111aaaaaaaaaaaaaa222222222222222222
     兩者中間大概有400bp左右是差異度比較高的，頭尾幾乎一樣，總長大約1500bp
     而primer是從頭到尾都夾

taq：Qiagen Multiplex PCR Kit

在加入kit中的Q-solution(據說明是增加產物專一度)前，可以跑出淡淡的band
但在加了Q之後卻跑不出東西來了，應該說讓negetive跑出東西來而且跟有+DNA的一樣亮

Genomic DNA 的量有用過10/50/100 ng 總體積都是25uL 結果都一樣

我想問我要怎麼改變條件，才能讓我的主產物更亮
才好用gel extraction後有夠濃的DNA送定序

PCR的溫度及時間：

淡淡band的一次
(拿別人用別的taq做的條件)
95-- 3min
95--30sec ─┐
58--30sec   35 cycle
72-- 1min ─┘
72-- 5min

依照我的taq修改...產物有band(不很亮)，但也出現其他不是產物的band
所以...實驗室有人建議加Q-solution試試
95--15min
95--30sec─┐
58-- 1min  45cycle
72--30sec─┘
72--15min

加Q-solution後，就沒東西了...
95--15min
95--30sec─┐
58--1.5min  55cycle
72--60sec─┘
72--10min

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推 CCC：問：現在房間只有2.9度，請問這樣的情況會不會下雪...
推 CCY：不會！牆角還有90度！
→ CCC：請問90度是華氏還是攝氏~
推 SBY：是a平方+b平方=c平方
推 WCC：所以躺在地上應該有180度?!
推 HKS：對~轉一圈有360度~~多轉幾圈要幾度有幾度(((喂~~~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.49.19
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1487224194.A.055.html
※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:50:43
※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 13:51:32
→ blence: 如果primer是1.5kb重頭到尾都夾,那2% agarose以及30sec的
→ blence: extension就不是合理的條件
→ blence: 這些在你用的Qiagen Multiplex PCR handbook也會有建議
B大，我重新補充了我試過的條件，我是打算回去用第二組不加Q-solution的
但還是想讓主產物再更多
其他不是產物的band反正我可以切膠切掉這OK，有好建議嗎？
※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:36:01

目前我的想法除了回到第二組的條件外(不加Q-solution)
就是拿跑過PCR的這些，拿一些出來再用相同的primer相同的condition再跑一次
(有番到某篇"增加PCR產物"的文)
但想到，若要做定序的話，好像要擔心複製出錯的問題？
還是其實OK就跑跑看也送定序看看？
目前我必須把這個條件確認下來，因為之後還有好幾隻老鼠要做確認 QAT
※ 編輯: taya1991 (120.126.49.19), 02/16/2017 14:53:14
推 jabari: gradient PCR跟前後多設幾對primer 就醬
推 eric2853: 你的產物是1500 bp嗎 是的話72度那步1分鐘可能還不夠喔
→ eric2853:  30s 500bp
推 patricksky: 72度C放長到1.5min
p大e大 好的 ！
推 darrenyo: 跑到45跟55 cycle有點多欸 ...
→ darrenyo: primer anealing 溫度跑gradient 72度C 改1.5 min
→ darrenyo: 並不是愈多Cycle就會愈好喔..
Cycle 數確實我只是想增加產物，handbook是建議30~45cycle
→ darrenyo: 另外你只是要genotyping的話應該不用考慮出錯率的問題
推 darrenyo: 錯幾個base不會影響你判斷結果
OKOK 我會思考看看
→ blence: 我是覺得為什麼你寫的condition會跟handbook的差這麼多
→ Ianthegood: 另外 幹嘛跑到2% 1.5K跑1%就很夠了吧
→ blence: 既然都購買優化過的kit了,改條件前也先參考default吧？
了解，我會以default+建議的annealing溫度重新來 thanks
→ Ianthegood: 還有ng level的template跑超過35個cycle大概只會把你
→ Ianthegood: 的產物燒壞...
I大 handbook是建議30~45個cycle ...
※ 編輯: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 20:50:44
推 jabari: 對了 難道你不能去跟廠商要他們genotyping的method嗎？
→ jabari:  說homo就真的homo @w@? jax的鼠兒嗎？
我了解你的意思，but......事情沒這麼單純，有點複雜...痾...這應掰不方便公開說((?
恩......
總之我會需要建立這套系統的~
※ 編輯: taya1991 (61.230.91.19), 02/16/2017 22:14:22
推 jabari: 了解 =.,= 那只好教個秘招...用R牌的probemaster 跑PCR...
→ jabari:  可能會有你要的片段大小 可惜含dUTP.. 如果有產物的話再
→ jabari: 想辦法跑nestPCR定中間片段
→ Ianthegood: appendix C看一下好嗎
→ WinnieDad: 梯度PCR跑一次，找最佳黏合溫度看看。
→ qazbamboo: Primer 大小？