Re: [求救] PCR 結果一直不理想或沒東西

[boblu (六百)]

你如果只是要鑑別你的 transgenic mice 身上帶的 transgene 是 A or B
好像不需要 PCR 全長吧？

不是說中間有 400 bp 差異比較大？

那就針對這個區域設計 A specific 跟 B specific 的 primers 啊

每一隻老鼠的 genomic DNA 拿來跑針對 A 以及針對 B 的兩個 PCR
看哪個有跑出來就知道誰是誰

目標 400bp 容易 PCR 而且這樣連 sequencing 都免了

甚至 你可以利用 A 與 B 在那 400 bp 以外的區域高度相似的特性

把 primer 設計成 AB-F(universal), A-R, B-R 三個

並設計成 AB-F + A-R 以及 AB-F + B-R 的產物 size 不同

三個 primer 放一個 PCR 反應跑 看產物大小就完成 genotyping 的目的惹

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→ Ianthegood: 哎呦對嘛 這才叫proper typing
推 taya1991: (做筆記中)  先謝謝六百！！
推 taya1991: 結果兩個gene實在太相似，這方法行不通，還是感謝！
→ boblu:  一條 primer 3' 最後那一個 base mismatch 就 PCR 不出了
→ boblu: 利用這個特性點突變都可以 PCR genotyping
→ boblu: 雖然實務上這種技巧有時有效有時沒效 case by case
→ boblu: 另外真的覺得定序才安心的話
→ boblu: 我還是建議不需要定全長 你挑一段 300bp 上下的去 PCR 就好
推 jabari: 那不如改成用qPCR跑HRM看melting差異.... 咦?
→ boblu: HRM好方法啊 只是原po不一定有設備