[求救]

[tynse71864 (TATA box)]

各位好， 手機排版請多見諒:

想請問有沒有做過 cell fractionation的實驗的版友呢?

由於 lab無人做過， 因此是自己按文獻的步驟進行 :
我的實驗有 wt跟 ko組， 想比較ko A蛋白後對於B 蛋白 (在 ER及 Gol)內的影響, 有試過 sucrose/optiprep gradient

這邊是材料與方法:

1.收集老鼠的小腸細胞於PBS中

2.將細胞以10mM HEPES,pH7.4 進行swelling (冰上5分鐘

3.加入2X的lysis buffer (最後濃度為10mM HEPES,250mM sucrose, 1mM DTT, protease inhibitor (1XPI)

4.使用tight-fit dounce homogenizer 磨30下 (冰上,約5分鐘)

5.cfg 1900g 10min (離掉unbroken cell跟核)

6.取上清, cfg 100000g 1h

7.此時上清應為cytosol protein, pellet為microsome (ER/Gol等)

8.將pellet 溶於250mM sucrose 中 (含10mM HEPES,1mM DTT, 1XPI),並滴於20~56% sucrose gradient上

9.cfg 39000rpm 18h (rotor:SW41Ti)

10.由上至下以pipetman取1ml,收集12個fraction

11.取部分做western blot, 並壓ER/Gol的 marker


目前的問題是， 我的 ER 跟Gol兩個部分分不開， 導致我無法比較兩者之間的差異
(按照文獻,Gol 約 fraction# 3-5, er# 6-12; 但我的做出來總是gol# 3-6, er 2-12)

https://goo.gl/Z5yRzd

(圖中我的gol還是會到後面...但大部分都在45之間,後面幾次實驗 Gol就比較集中在4~5
可ER每次都會從2~12)




已經試了快半年了仍然沒什麼進展， 也已經向不同 protocol的作者詢問細節，
 仍然是無法解決， 因此想上來問問是否有做過類似實驗的版友可提供意見呢? 謝謝!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.83.135.57
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1488710064.A.5D6.html
推 alaric: 先找你的指導教授討論吧. 找人檢查你的方法流程.
老闆本身沒有做過相關實驗;我跟他討論了很多次,也試了6次左右,仍無法解決

我有跟做類似實驗的國外作者們通信過, 給的資訊有改善部分結果
→ Ianthegood: 然後你的方法材料都不明不白 板友如何隔空抓藥
抱歉發文當時無資料,已補上

推 Ianthegood: 首先是你壓的marker跟作者的不一樣啊 cnx那隻的signat
→ Ianthegood: ure就差沒有太多 然後你如果要看兩個胞器內的差異你就
→ Ianthegood: 抓幾個最純的fraction同時壓你的protein還有golgi跟er
→ Ianthegood: 的marker當作standardisation就可以了吧
→ Ianthegood: 要收到純的胞器可以說是不可能
Syntaxin6是家裡剛好有順便壓一下

MTP在原文獻中也是作為ER marker (位置同GRP94)

https://goo.gl/eUUhp6

這是其他次實驗的結果

應該說我的實驗結果會飄...也無法像paper一樣分的那麼好

推 Ianthegood: 因為dounce本來就是irreproducible啊XD 加上你samplin
→ Ianthegood: g用pipet 我們家在分gradient都用快停產的機器在分才
→ Ianthegood: 能ensure reproducibility
我知道有蠻多用nitrogen bomb,但也是很大部分用Dounce?

我們家是有分gradient 那台機器, 只是管子必須用polyallomer的
目前手上全都是ultra clear戳不了洞QQ
※ 編輯: tynse71864 (203.71.62.165), 03/07/2017 11:40:03