[求救] WB internal control 定量問題

[yvette26 (小軒)]

其實是我們家另一個助理到別人家去學回來的protocol，

但是在一開始定量的部份讓我想破頭都不確定邏輯通不通...

希望能有高手幫忙解惑，謝謝~


我們家跑WB前會先把sample用分光光度儀，595 nm測吸光值後，

算好個別濃度，再決定每個well要loading的量。

別人家是不測吸光值，

第一次都先直接loading一樣多的sample，然後直接跑internal control (tubulin)，

跑出來的結果去反算sample應該要loading的量，

所以第二次可能每個well sample量都不一樣，但internal control是一樣的。


雖然乍看之下好像沒甚麼大不了，但是總覺得...不夠嚴謹?

對方的解釋是說，他們覺得以internal control為標準就可以了，

但如果sample個別本身的internal control就有差異了呢?

還是這已經是可以通用的規則，internal control就能當標準化使用?

如果已經是通用標準的話我想就接受了，不然還是回來遵循老方法吧...


希望有人可以跟我討論，謝謝~


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→ a90648: internal control會有變化的話就不能這當internal control
推 huangsw: 先說你的材料來料是啥? 那你用595nm測的原因是?
推 huangsw: 推a大的 internal control不應該有差異
推 qiet: 第一次聽到有人這樣算, 不覺得很浪費時間嗎, 要跑兩次膠ㄟ
→ tz2733: 你有找到一篇paper是這樣寫就知道可不可以啦~
推 darrenyo: 不管怎樣在正常情況下你的Data的 internal control
→ darrenyo: 都要一樣啊 所以理論上不管是用哪個方法最後結果都一樣
→ darrenyo: 只是你定量可以訂的準的話就不用多跑一次啦
推 darrenyo: 只是不太懂你測595nm是? protein assay的結果嗎?
→ Ianthegood: 595是bradford吧
推 Ianthegood: internal control不是本來就該當作standardisation?
→ Ianthegood: 不然你在paper裡看到每個lane的actin一樣粗是怎麼做
→ Ianthegood: 的?
→ blence: actin一樣粗有不同方法阿,前定量-assay OD;後定量-試跑膠
→ blence: 或者複製貼上(誤)；一般都是採前定量,而不是原po的後定量
推 tz2733: 好奇原po說的這種方法 第二次跑出來的internal control真
→ tz2733: 的會一樣嗎?
→ Ianthegood: 就試跑當作前定量囉 應該真的會一樣粗吧
→ raiyu: 有聽過 前助理他碩班的實驗室是這樣"定量"的 (雖然我覺得有
→ raiyu: 點...作假的感覺...我個人感覺啦
→ Ianthegood: 怎麼會 都是在算target protein跟standard的相對量啊
→ Ianthegood:  qPCR不是也這樣算
→ raiyu: 定"蛋白"跟定"圖片"的差異 呈現的結果可能一樣但定義不同
→ a90648: 但是圖片反映的是蛋白的量阿!哪有不同?
→ a90648: 那照你的說法qPCR不就定螢光強度和定RNA量的差異?
→ Ianthegood: r是覺得一定要某個機器給你一個數字才是準的嗎XD 你去
→ Ianthegood: 看看bradford的manual給的範例bsa跟lysozyme的濃度/吸
→ Ianthegood: 光值比差多少
→ raiyu: 我就說我個人"感覺"了啦
→ raiyu: 因為有遇過藥是會影響tubulin的 當然就必須用別的internal
→ raiyu: control了 但如果在一開始不知道的情況下直接以此方法定量
→ raiyu: 的話會有miss 當然也可以一開始第一次就把所有能當internal
→ raiyu: control的蛋白都壓一遍啦~~~~(攤手)
→ raiyu: 回I大 圖片出來不是也有一個值嗎XDDDDDDD
→ raiyu: 總不會是用眼睛看吧 不然定出來後如果不同要怎麼調整??XD
→ raiyu: 總要有依據吧XDD
→ raiyu: 回a大 是呀 是以螢光強度代表RNA量 不是嗎??(抓頭)
→ a90648: 所以在使用的internal control沒問題的狀況下
→ a90648: 圖片就代表蛋白量啦
推 tz2733: Western Blot Normalization:
→ tz2733: Challenges and Considerations for Quantitative Analysi
→ tz2733: s
→ tz2733: 有空可以找一下這篇 有原po你說的標準方法 還有Normalizat
→ tz2733: ion的方法 可能可以幫助你