Re: [求救] WB internal control 定量問題

[tz2733 (這就是人蔘呀~)]

跟老闆討論了一下這種方法是否可行
老闆說不行...
試著分享提到的幾個觀點
1.WB經過一抗二抗呈色出來的不是線性放大
所以此法不可行

(此外 我個人的經驗是  單單是曝光時間不同兩個band之間的倍數差異就會不同 可能1:2
 變成1:1.8之類)

2.蛋白質濃度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸 這生化有教)來標準化sample
internal control則是一種蛋白質  當然是前者比較能正確標準化sample
(我表達的詞可能不是很正確但希望提出來大家想一想)

3.會出現這種方法可能是因為收組織樣本品質不一造成internal control band會粗細不
一 所以才用這種方法掩蓋樣品收集的問題
(例如有無灌流完全 週邊的脂肪組織是否有去除等都會造成internal control在等量prot
ein跑WB band粗細卻不同 )

所以我建議原PO還是別用這種奇特的方法跑WB吧....

paper多數都會寫loading多少量的total protein  所以都是有測蛋白質濃度後等量去跑
的吧...

大家參考~


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→ a90648: 1.但是大家都是1:2變1:1.8 對相對定量來說不影響
→ blence: 第1點不太同意,因為assay也會有倍數差異情況,關鍵在訊號飽
→ blence: 合度;不要把paper那種又大又肥的band拿來比喻
→ blence: 第2點,濃度是測特定AA而已,嚴格說也無法代表蛋白質含量阿
→ blence: 第3點,雖然我看過以特定蛋白質來定量的paper不超過五篇,但
→ blence: 但至少也真的有方法這麼做;而文字上也可以用reference
→ blence: 蛋白的量來呈現target蛋白的量,說明清楚即可
→ blence: 而類似的例子也有phospho/total protein的描述方式
→ blence: 另外我不覺得paper特別偏好load ug數,如果是幹嘛秀control
→ Ianthegood: 回完了才發現b大都講完了XD
→ blence: 你寫的比較清楚完整阿
→ tz2733: 請問b大說的"那幹嘛秀control"是指internal control的圖
→ tz2733: 嗎?還是指control組?
→ tz2733: data不是要用除internal control後的ratio來計算 ?
→ Ianthegood: 除下去就也是normalisation啊XD
→ tz2733: 所以我以為要秀internal control圖的用意是因為ratio~ 如
→ tz2733: 果說兩組別照原po方法第一次internal control 不同曝光後
→ tz2733: 計算是1:2或1:1.8,那第二次跑膠是sample改成要loading量 2
→ tz2733: :1或1.8比:1  這樣對要看的蛋白的"組間"差異不會有影響嗎?
→ tz2733:   如果這個蛋白組間差異小2:1或1.8:1 可能就看不出來到底
→ tz2733: 有沒有差別了吧  所以我才會提出這個經驗來講 但不知想的
→ tz2733: 對不對
→ blence: 別管原po的方法了;在第1點,你(或老師)認為測濃度定量比較
→ blence: 準確可行吧？ 那你們的paper是不是只需要寫放多少ug就好,
→ blence: 不需要放actin,tubulin這些internal control了嗎？
→ a90648: http://imgur.com/4OI69Bw 舉個例子
→ a90648: 有錯的話，麻煩幫忙修正一下謝謝
那為何要跑第二次?
→ blence: 倒數第二行的B/IB應該改成Tb/Ib更有一致性
→ a90648: 謝謝b大指正，修改好囉!! http://imgur.com/Jis7xxa
→ a90648: 暈了= = 這次變打錯符號... http://imgur.com/qOnjGgA
→ a90648: 邊吃飯邊弄一直修錯QQ http://imgur.com/Sp4xvfG
我上面講的同次操作曝光造成的差異不是你舉例的情形
→ tz2733: 回覆 blence   我們是覺得原po方法這樣反推不可行 不是覺
→ tz2733: 得只要訂量蛋白就可以了 正規是用同樣ug下去跑WB 然後觀
→ tz2733: 測的特定蛋白再除internal control得到ratio值 再去比較
→ tz2733: 組間ratio值差異 paper一般看到也是說明多少ug 然後也會
→ tz2733: 有hy internal control 所以應該是跟我們一樣做法 如果是
→ tz2733: 用原po反推法的 根本就不會寫出是用多少ug 因為沒測protei
→ tz2733: n濃度呀
→ Ianthegood: 你除下去不就是用internal ctrl在做normalisation
→ Ianthegood: 而且最可能的情況是他跑第一片膠前就測過濃度了
推 darrenyo: equal amount 也是常見的寫法啊 更何況有些根本沒寫
→ blence: 文中對於以internal control作為normalizatio的不置可否
原po文
"別人家是不測吸光值，

第一次都先直接loading一樣多的sample，然後直接跑internal control (tubulin)，

跑出來的結果去反算sample應該要loading的量，

所以第二次可能每個well sample量都不一樣，但internal control是一樣的。"

我是對用internal control的band去定量作為取代蛋白質濃度測定不同意 不是你說的這
樣意思
→ blence: 我只是以實際狀況提出反證
→ blence: 你用濃度ug去定量再用internal,最終還是依照後者為主阿
→ blence: 以達到一致loading的data呈現,internal還是比ug令人信服
→ a90648: 可用的internal control就是可以忠實的反映loading蛋白量
→ a90648: 蛋白濃度高internal control就多反之亦然
internal control是反應蛋白質總量還是反應細胞量?
→ blence: 對於原po的後定量,實際操作或許會遇到需要2~3次測試
→ blence: 來達到一致laoding量,因此我不認為會比你的方法還不可行
→ blence: 當然,這種方法太麻煩厚工是缺點,我自己也不那麼做
→ a90648: 忽然想到!! 現在的問題會不會是t大沒弄清楚他所說的
→ a90648: 特定蛋白再除以internal control得到ratio值
→ a90648: 這個步驟所代表的意義是甚麼?
我知道ratio是什麼意思啦~應該說我覺得等量蛋白跟normalisation不相等 所以定量跟in
ternal control都要做 定量還有其他意義 像看loading的蛋白量是否合適之類的 例如有
些特定蛋白可能細胞組織要多一點量才能hy出來 這在看paper時就會參考到 我詮釋原原p
o說從別家學回來的方法是"不測濃度的" 但受限於internal control的band實在容易很亮
根本超過與蛋白量的線性關係 且大家都說該方法可行前題是internal control是穩定不
受影響的 那原原po這樣反推讓其internal control"做"成相等 不就怪怪的? 我不是在說
用internal control作normalisation不行呀呀呀~~~
※ 編輯: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 08:22:01
→ a90648: 再用同體積lysis buffer收蛋白的情形下細胞多蛋白就多
→ a90648: 而在用不同體積收蛋白的情形下，濃度高，control也會高
→ a90648: 不論是訂濃度跑還是訂control再跑一次，你所使用的control
→ a90648: 一定要是穩定不受影響的，這是一定要遵守的條件
→ a90648: 取同樣量的蛋白但跑出的control卻差很多
→ a90648: 這個control就不能用
→ a90648: 而後定法就是利用internal control作normalization
→ a90648: 但是這方法至少要多跑一次膠，也要注意band是否過曝之類的
→ a90648: 相對於一開始就測濃度要注意的地方更多更麻煩
→ a90648: 我也是一開始就乖乖測濃度去跑就好了
→ a90648: 但不代表這樣做就是錯的
我的想法是這樣的 WB主要目標是想知道細胞內某蛋白表現量變化 但因實務上的限制 無
法求得單一顆細胞的蛋白表現情形 所以改以測protein assay去看等量蛋白下某蛋白的表
現 量 而internol control則是當操作ok時 應該會出現相似表現量的結果 但可能甲inte
rnol control會變化 所以換乙 計算data 這是要去normalize細胞數及一些操作上的小問
題 如果照你認為可行的後定量依internal control去回推調整sample loading量 那這層
意義就消失了 WB追求且必要的並非internal control一致 那是操作ok伴隨可能會出現的
現像 且因需要作normalize而有ratio的計算
→ a90648: 而且是原PO家的助理不是原PO這樣做啊XD
→ blence: 當以internal cont做normalize,就暗示了load sample不同量
→ blence: 你以internal control做normalizsation,就等同把internal
→ blence: "做"成相等的意思;如果你認為不該做成相等,那測完濃度後
→ blence: 直接跑膠,定量target就可當成表現量,何需要除以internal呢
→ blence: 實際上的操作我常常像你的做法,但在敘述上,normalisation
→ blence: 跟"做成相等",被你當成認定是不同意義,這點我不認同
我也思考了一下為何我覺得不同 我發現我覺得不同的應該是 等量跑膠+internal contro
l normalisation(ratio)與直接用不等量跑膠定internal control band +回推比例loadi
ng這兩者不同      這兩者不同的地方在於有測濃度等量去跑可以說是穩定實驗操作品質
的方法之一 (跟normalisation不同)  而後者方法要可行的前題限制太多 這樣的手法是
否會帶來實驗品質的變異性增大? 這是兩者間的不同 不是單用計算或推理出來可說兩者
相等的 如果真要用後訂法 是否先跑膠染total protein去做sample的調整比單看單一 in
ternal control 合宜? 我找了網路資料試著釐清自己的想法"Western Blot Normalizati
on:Challenges and Considerations for Quantitative Analysis"  可以看4的部份 標
準方法一直沒變過 只有後面normalization的計算法不同 這是我粗略看過去的心得
※ 編輯: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 12:40:47
※ 編輯: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 14:23:58
→ blence: 我不認同"WB追求且必要的並非internal control一致.......
→ blence: 後面那一段話,也不認同"需要作normalize而有ratio的計算"
→ blence: 原因1.你就秀不一致的internal control,再看paper買不買單
→ blence: 原因2.如果僅是需要normalize,何必還去跑internal cont.
→ blence: 你以ug就去normalize就好,每個lane有多少ug都被固定了阿
03/08 14:52
→ blence: 而且,你也提到,當甲蛋白會受到實驗變化時會,改用乙蛋白
→ blence: 不就暗示對你而言,用ug總量就好,internal cont.完全不用跑
03/08 15:00
→ a90648: 依internal control去回推調整sample loading量
→ a90648: 就是你所說的normalization阿!! 只是前定量是計算出數值
→ a90648: 而後定試是反映到loading量去實際有動作的調整
→ a90648: 而在前定量出現甲不一致改用乙計算時
→ a90648: 後定量當然也是要跟著用乙阿!! routine的實驗中哪個
→ a90648: control可用這是已知的是，前後定量不會有差異
→ a90648: 但在第一次做實驗時，一定會看複數個control才能知道
→ a90648: 哪個是可用的，這在前後定量都是一樣要做的事情
        03/08 15:19
如果有空可以看一下我上面提的那篇 "Western Blot Normalizati
on:Challenges and Considerations for Quantitative Analysis"

我大概就回覆到這裡了
※ 編輯: tz2733 (42.73.245.230), 03/08/2017 15:58:39
→ a90648: 你舉的同次曝光時間不同造成的差異，當1:2變成1:1.8時
→ a90648: 代表已經過曝啦 請降低曝光時間
→ a90648: 至於我舉的例子為什麼要跑第二次，第一次的結果
→ a90648: control粗細差了兩倍，雖然相對定量的結果不會變
→ a90648: 但是請問投paper時會放這種圖嗎?
→ a90648: 至於你提到的那篇的第4.2最後兩行就是再說後定法囉
→ a90648: 但就如前面大家提到的，internal control的選擇是很重要的
→ a90648: 當然裡面提到用Coomassie staining去看loading是否準確
→ a90648: 也是可以的
→ a90648: 雖然裡面是說去確認測的蛋白濃度是否準卻
→ a90648: 而後定法就是類似的作法只是少了一開始的測量濃度
→ a90648: 基本上該說的大家也說得差不多了，而原PO也說了兩種做法
→ a90648: 得到的結果是差不多的，後定法是否真的有問題
→ a90648: 就讓大家自己做判斷了
→ raiyu: 總算有心力來認真看一下&提一下我的疑問點
→ raiyu: WB的比較是在同一個基礎下去做比較的吧 前定量法loading時
→ raiyu: 就是loading相同的蛋白量(不論定得準不準) 所以比較點是在
→ raiyu: 相同蛋白量上去做比較 那看paper的人要怎麼知道你是真的同
→ raiyu: 蛋白量呢? 所以我們會放所謂的internal control來顯示我是
→ raiyu: loading一樣的蛋白量 所以internal control只是用來證明我
→ raiyu: 是loading一樣的證據
→ raiyu: 那後定量法 在我的感覺上 變成我loading的是"相同tubulin
→ raiyu: 量(or其他internal control) 這2者雖然看起來一樣但定義
→ raiyu: 不太一樣吧???  有點像白馬非馬
→ raiyu: 雖然在實際操作時 我要看我定量定得準不準也是看壓出來的
→ raiyu: internal control.....= =||
→ a90648: internal control的定義就是他可以反映loading的蛋白量阿
→ a90648: 在使用的internal control沒問題的情形
→ a90648: 定loading量和定internal control是一樣的事情