Re: [求救] WB internal control 定量問題

[Ianthegood (厭惹故)]

   恕小弟不甚同意，一些觀點供大家參考


※ 引述《tz2733 (這就是人蔘呀~)》之銘言：
: 跟老闆討論了一下這種方法是否可行
: 老闆說不行...
: 試著分享提到的幾個觀點
: 1.WB經過一抗二抗呈色出來的不是線性放大
: 所以此法不可行
: (此外 我個人的經驗是  單單是曝光時間不同兩個band之間的倍數差異就會不同 可能1:2
:  變成1:1.8之類)

   首先這裡我想問的是，貴老闆不同意的是

  「以western的band粗度量化來做線性normalisation」

  還是

  「以單一/數個protein的western band來做normalisation的概念」?

   因為前者是技術問題, 我們已經積年累月的用western的band來做相對定量,

   就算不準, 整體的趨勢也是看得到的(up/down regulation), 雖不中亦不遠矣.

   如果要線性的話現在有很多CCD的機器開始可以做到,typhoon, LiCor等

   如果是後者的話那我也不懂了, 如果這樣的normalisation沒有credibility,

   那以loading量normalise 壓完western後又何必再壓actin/GAPDH?


: 2.蛋白質濃度定量是用某胺基酸(依不同方法而不同胺基酸 這生化有教)來標準化sample
: internal control則是一種蛋白質  當然是前者比較能正確標準化sample
: (我表達的詞可能不是很正確但希望提出來大家想一想)

   我舉幾個極端的例子, 小弟現在在做的model最大表現量的蛋白只有一個aromatic AA

   意思是這個蛋白如果暴增5倍 我測280基本上測不到這個蛋白的變化量.

   你說其他方式會比較準確嗎? bradford吃蛋白pI吃很兇, 你看原廠manual的範例

   BSA跟lysozyme兩條standard curve斜率差多少, 而且也不是線性

   BCA稍微好一點但是對buffer condition的要求甚高, 你裡面有點其他東西他就會給你

   加一堆吸光值上去

   我想要表達的是, 沒有一個(至少現在)protein assay是真正準確的, 除非你家裡

   有一台常常保養的maldi. 我們家很龜毛的博後真的要定量還會一個sample

   用三種方式定過XD

: 3.會出現這種方法可能是因為收組織樣本品質不一造成internal control band會粗細不
: 一 所以才用這種方法掩蓋樣品收集的問題
: (例如有無灌流完全 週邊的脂肪組織是否有去除等都會造成internal control在等量prot
: ein跑WB band粗細卻不同 )
: 所以我建議原PO還是別用這種奇特的方法跑WB吧....
: paper多數都會寫loading多少量的total protein  所以都是有測蛋白質濃度後等量去跑
: 的吧...
: 大家參考~

   最後我想講的是, 所有實驗的所有standardisation都一樣, 前提是你的target gene

   必須是你當時細胞狀態/體積/數量/你想要看的什麼條件的忠實proxy,

   像在跑E coli overexpression的時候我想大家應該也都用OD在做standardisation

   RNA/qPCR你也得確定你的actin或是GAPDH這個處理下沒有變化才拿來做delta delta T

   如果這個條件不成立, 就算你用loading量做normalisation, 你的internal ctrl

   變化量太大也一樣會被鞭.

   一點想法供大家參考.

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推 tz2733: 回答2 因為我家作細胞但非特殊表現蛋白那類實驗 所以老闆
→ tz2733: 這樣講應該算合理吧?  然後1 我老闆應該有一部份是在講ble
→ tz2733: nce提到的飽和問題 原PO作組織 要確定第一次跑膠loading量
→ tz2733: 的tubulin沒飽和 實務上是不是會很複雜? 其實我也沒完全
→ tz2733: 聽懂老闆講的 覺得這議題很有趣 大家可以討論~
→ a90648: 根據取的組織量，用的lysis biffer的量來判斷load的量
→ a90648: 一般是不至於會load到control爆表的量啦!!
→ tz2733: 樓上這樣說讓我想到 我有看過paper是寫等重量組織去跑膠
→ tz2733: 的    是秤重組織等重量 沒測蛋白濃度
→ Ianthegood: 第二點 我沒有說貴老闆是錯的 我只是覺得沒有比較對
推 chihsiao: 應該是-zation結尾吧