[求救] 螢光蛋白fusion protein 表現

[windyflyer (重新尋找)]

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以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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各位大大好

我最近在試圖接一段fusion protein，預計將mCherry接在我要表現的A protein的N端

一開始之所以會決定接在N端是因為有PAPER將RFP接在A  protein的N端，所以才打算

照做。我的mCherry與A protein中間有間隔約10個胺基酸。有確定in-frame。

但接完之後送細胞→收cell lysate並以mCherry抗體卻沒有東西T_T倒是單純mCherry

表現載體則是有band的。收protein之前看螢光，fusion protein也是沒有亮，而單純

表現mCherry則有發光。

當初接好後因為A protein大小過大(3399bp)所以沒定序就直接送細胞測試了。


想請問大家的意見@@"因為我不確定這樣的fusion protein是不是太大了才導致整個蛋

白表現瓦解?


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→ Ianthegood: rfp跟mcherry同源嗎? 我自己沒做不過我們lab的mcherry
→ Ianthegood: 都放在C-ter
→ Ianthegood: 要定序啦 另外可以做RT看mrna有沒表現
推 tynse71864: 有用A Ab去認過fusion protein嗎
推 Bows: mCherry 的 stop codon?
推 Bows: 沒事，應該不會是這個ㄩㄢㄧ
→ windyflyer: 有 但沒看到任何shift@@"
→ windyflyer: 已經貼細胞下去要收RNA了 不過對於沒螢光/沒protein
→ windyflyer: 這件事感到疑惑QAQ
→ Ianthegood: 中間linker的sequence?
→ blence: 都沒定序如何知道是A,是A從別的plasmid切來的? 該plasmid
→ blence: 應該也沒定序,這樣如何知道是in-frame呢？
→ blence: 猜測源頭有問題,因為若A在其他plasmid表現過,文中應該會提
→ a90648: 我蠻好奇因為3399bp而沒定序的原因是?
→ a90648: transient transfection做Q，DNaseI要處理好喔
→ a90648: 免得P到的都是丟進去的那堆plasmid
→ a90648: 染mCherry時是整片染還是裁預計大小上下一點的部分看而已?
→ windyflyer: 我重新clone一次之後有壓出來了~位置都對T_T