推 tynse71864: 咕狗一下 “SidE LCV” 03/27 23:56
自問自答
我試了第二次後應該算成功了
第二次改變的條件有
1.cell lysate時加強sonication的能量
2.做gradient時確實vortex 讓不同濃度確實均勻 gradient加完立刻超圓心
3.提高轉速到4萬rpm (之前依照說明書建議換算是3萬rpm)
這次cell lyaste還是透明的 硬取最上層2ml來做WB
跑出來的結果兩管lysosome fraction的LAMP1比total lysate 濃上許多
其他內容物比例也不同
但現在遇到的疑問是beta-actin
平常用beta-actin做control
這次也順手染了beta-actin 結果total 和lysosome fraction出來是差不多的
查網路只知道cell fraction中beta-actin表現在cytoplasma, nucleus 比較少
查不到beta-actin在lysosome的比例 不知道有人能分享一下經驗嗎 謝謝
※ 引述《hachibuya (黃金騎士 牙狼)》之銘言：
: 我使用ThermoFisher的kit
: Lysosome isolation kit from tissue and cultured cells
: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/89839
: 試著分離MDA-MB-231乳癌細胞的lysosome
: 結果分離出來的東西做WB和total cell lysate有八七成像
: 表示分離完全失敗
: 我遇到的一個問題是說明書上的範例使用A431 cell
: lysate完是乳白色液體 超離心後會有很明顯的分層
: http://i.imgur.com/NwQwo8H.jpg
: 但是我的cell lysate是透明的 離完心全部都是透明的
: 我只好假裝有分層取最上層2ml的液體來分析
: 結果是失敗的
: 不知道有沒有人有經驗能幫幫我的
: 感激不盡
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※ 編輯: hachibuya (133.87.71.225), 03/27/2017 14:34:00