[求救]Bradford定量法求助

[knowledge265 (lonelyvenice)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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因為實驗室以往做western blot都是用2X denature sample buffer(不定量)直接去溶蛋
白,沸水煮5-10分鐘,離心就直接開始跑
最近開始想用lysis buffer以bradford配上BSA定量方式去做比較準確,而我實驗室上面沒
人能教我只能自己摸索,請各位指教一下
BSA先稀釋成0.5mg/ml 再開始拉標準曲線

BSA(0.5mg/ml)      1 X Bradford      最終濃度(ug/ml)
500ul                   0                  0
495ul                   5ul                5
490ul                  10ul               10
480ul                  20ul               20
450ul                  50ul               50
475ul                  75ul               75
400ul                 100ul              100

然後以595nm測吸光值 拉標準曲線 得y=0.012x+0.458

再來測我的樣品蛋白是以
1 x Bradford 499 ul 配上 樣品蛋白 1 ul 再測吸光值後帶入標準曲線

舉例我其中一個樣品測得為24.08請問單位是ug/ml還是mg/ml?
而我要不要把499ul 的bradford看做稀釋再把倍率乘回去呢?

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推 ad1980: 跟你用來測吸光值的 BSA 同樣的單位
→ ad1980: 你畫 standard curve 時 BSA 那個軸是用什麼單位，你的 sa
→ ad1980: mple 算出來就是那個單位。
推 icheee: 看了一下覺得跟我看過/做過的方式不同... 一般不是都把
→ icheee: BSA 標準品作為限量試劑, 然後用相同量 (過量) 的 Bradf-
→ icheee: ord reagent 去反應嗎?
推 qiet: 你這樣不是每一管的Bradford reagent量都不同嗎
→ qiet: 產品protcol先看看吧
推 icheee: 這條檢量線看起來比較像在做 Bradford reagent conc. 的檢
→ icheee: 量線...
→ knowledge265: 抱歉我上面標準曲線打反了
→ knowledge265: Bradford是500 495 490那排
推 icheee: 如 q 大所說, 一般作法是固定 reagent 的量 + 固定 sample
→ icheee: 的量 (指體積). 所以假設 Bradford sol'n 都用 500 uL, 樣
→ icheee: 品/標準品都用 20 uL (體積不足用水或溶解/稀釋 BSA 的溶
→ icheee: 劑補). 這樣再回來看, 應該你的問題就可以解決了.
→ icheee: 至於如果硬要用你現在的步驟來看, 你測得的 24.08 是 ug/
→ icheee: mL. 按你的目的是該把稀釋倍率考慮進去 (*500), 推回原本
→ icheee: 的濃度. (要用 ug/mL 或 mg/mL 表示就看你認為怎樣恰當)
→ knowledge265: 所以次哦這樣定的方式也是可以的囉？
推 rusly: 你有實驗的protocol嗎，為啥跟大家學的好像不一樣？
推 icheee: 不行吧 我只是直接回答你問題
推 formoxa: 為什麼不跟著產品說明書做一次。