Re: [求救] site-directed mutagenesis

[kaofei (phoebe)]

大家好，又是我，但這次有新的問題，所以借用實驗設計時參考的文章

這次是做single site 的 site-directed mutagenesis

我有個Toxic insert一直很難clone，好不容易篩到colony卻有frameshift mutation

所以我參考這篇文章跟內容提到的paper做了SDA想把Sequence 矯正回來

我用的competent cells是clontech的stellar competent cells

transformation後用30度C recover然後室溫養兩天

挑了三個colony送定序其中兩個有把我要的序列改回來

但都出現了新的Deletion或insertion

下面是其中一個plasmid的結果

序列從 TCACTTTTGATGTTCACACG-GAG

變成   TCACTTT-GATGTTCACACTCAAG

              ↑不要      ***要

出現新的mutation的位置都在primer上，F跟R都有

我想請問

1. 這跟primer有關嗎？

2. 這在Site-directed mutagenesis常見嗎，因為我是第一次試實在沒甚麼經驗

3. 還是純粹就是我的insert不穩定，competent cell喜歡自己亂改序列orz

4. 可否提供我任何建議或可以嘗試的方向

指導老師說再不行就insert砍半或直接用合成的

謝謝！！


※ 引述《tutj (人生若只初相見)》之銘言：
: ※ 引述《nhxcyge (人生就像個不可逆反應)》之銘言：
: : 我現在是做A基因的點突變，
: : 用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間
: complement primer應該是stratagene QuikChange的方法吧？
: : 利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb
: : 目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…
: : 曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution
: : 但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。
: : 另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法
: : 心想應該行不通
: : F1---------->                               F2--------->
: :       ------------------------------------------------------
: :       ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
: :       ------------------------------------------------------
: :                                             R1<---------
: :                                                         R2<----------
: : 二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2
: : 夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。
: : 所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？
: : Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。
: 你的Tm值是照說明書的公式算的嗎？
: 我有找到一個網站可以幫忙算
: http://depts.washington.edu/bakerpg/primertemp/primertemp.html
: 如果你是照公式算, 說明書要求至少要78℃以上; 如果不是, 那Tm值一定太低
: 這方法Tm值一定要夠高。因為primer完全complement, 還有突變的base
: 所以primer間的Tm值會比primer對DNA template的Tm值高
: 如果一開始設計的Tm不夠高
: PCR時primer會傾向形成primer dimer而不是黏上DNA template
: 至於你說的PCR產量低, 我之前有找到一篇paper
: 裡面說QuikChange有幾個缺點。 一是上面提的易形成primer dimer
: 二是不能同時多點突變; 三就是PCR產量低。
: 因為PCR從primer順著plasmid跑完一圈後頭尾接不起來形成nick
: 一對primer又是完全complement
: 整個PCR program只有parental plasmid可以做為DNA template
: 那篇paper發明了一種新方法
:                       F1 ---------m----------->
:       ------------------*-----------------------------------   *: nick
:       ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||   m: mutation
:       -----------------------------------*------------------
:               R1<-----------------m------
: 如圖, primer間只有部份overlap, mutation site在overlap region中間
: 3'延伸出去的部份蓋過PCR產物的nick
: 所以新生成帶有mutation的DNA可以當成template進刪PCR reaction
: 故一開始需要加入的DNA template可以降低, 提高之後挑mutant colony的機率
: paper現在不在手邊, 如果你有興趣等星期一去實驗室我可以提供
: 根據我整理的protocol
: 這邊primer跟template之間的Tm值稱為Tm no, primer-primer間的Tm稱為Tm pp
: 設計primer時Tm no要比Tm pp高5~10℃
: PCR reaction的配方: 1x PCR reaction buffer, 1 uM primer pair,
: 2~10 ng DNA template (我用5 ng), 0.2 mM each dNTP (我怕不夠加到0.4 mM)
: 3u Pfu polymerase (其他DNA polymerase應該也可以), 補水到50 ul
: PCR program:
: 1. 95℃      5 min  x1 cycle
: 2. 95℃      1 min  (cycle數我照QuikChange的建議, 換掉a.a.跑16 cycles)
:    Tm no-5℃ 1 min
:    72℃      1 kp/2 min
: 3. 95℃      1 min  x1 cycle
:    Tm pp-5℃ 1 min
:    72℃      30min (據說此cycle能增加完整plasmid的生成率)
: elongation因為我用PfuUlatr II, 所以減到1 kb/min, 跑68℃
: 然後primer因為高GC% Tm值超高,減五度也超過65℃
: 所以annealing照QuikChange跑55℃ 最後一個cycle省略成只跑72℃ 30min
: 取10 ul PCR product跑膠有超亮的single band
: 提供給你參考~

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.208
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1490681097.A.B5A.html
推 yoke12071015: 我經驗是primer品質影響蠻大的，所以至少要有OPC
→ yoke12071015: 有時候遇到突變就是遇到了，再挑幾顆或是再重試試看
→ blence: 我有一個construct就是這樣,site-direct後在別的位置出現
→ blence: mutation,而且不是site-direct時primer所涵蓋的位置
→ blence: 後來放棄了,改買origene ready clone也有突變,客訴後重送
→ blence: 原突變改回來，但其他位置又突變
→ blence: origene於是把產品下架退錢
→ kaofei: 所以就像樓上，可能是這些sequence真的很難clone的關係？
→ blence: 我試過pBSII,pCMV,pcDNA,pET,pENTR等好幾個clone,以及包含
→ Ianthegood: 你的strain?
→ blence: stbl等strain後才確認的,你的問題自己比較知道
→ huosheng: 有些想法可以執行看看：如果primer過長，超過40bp，可以
→ huosheng: 考慮PAGE純化；另一個，如果insert過於toxic，可能表現
→ huosheng: 的菌不會活，那換個less express的vector backbone
→ xxtomnyxx: 我想序列正確的菌應該都是活不下來，所以只能挑到序列
→ xxtomnyxx: 有錯的菌，你的實驗會需要在細菌中表現這個蛋白質嗎？
→ xxtomnyxx: 如果需要那大概無解，如果你只是要用菌來擴增你的質體
→ xxtomnyxx: ，可以試試看在這個 insert 的 ORF 前面放 Termination
→ xxtomnyxx: sequence，讓細菌不去產生這個有毒的蛋白質。
推 lail: 這個實驗的primer我會做PAGE，有些錢不能省
→ milkpa: 試著用low-copy plasmid做
→ kaofei: 我的primer是用OPC合成，所以可能是因為純化方式不夠嗎Orz
→ kaofei: 百密一疏唉...
推 huosheng: 即使是opc也可以完成，只是PAGE會讓你primer的純度上升
推 truelight: 之前做的時候老闆是有強烈建議一定要PAGE純化比較好