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作者MLSHBen (酷喔)
看板Biotech
標題[求救] PVDF membrane可否這樣保存
時間Tue Apr 25 03:56:47 2017
大家好 想請問transfer過後還未加一抗的PVDF membrane是否可以先保存於4度1x TBST （不知是否需要先做blocking） 然後隔天再加一抗（先blocking）4度o/n 因為我的抗體隔天才會來，想先看別的位置的protein的表現 而我的抗體要看磷酸化的protein，聽說磷酸化的protein不穩定 所以不知如果可以這樣做，是否會影響membrane上的磷酸化protein？ 查版上好像是ECL後如果要保存會烘乾，要用前先加methanol再一抗二抗 另外想問因為我會連續幾天跑Western，然後這抗體會用很多次 不知是否可以第一天4度搖o/n的稀釋抗體吸起來先保留在4度 然後給第二天的Western搖4度o/n 然後給第二天的Western搖4度o/n 然後給第二天的Western搖4度o/n 因為data sheet建議稀釋倍率是1:1000，不知這樣效果是否會減弱很多？ 又學長建議我4度o/n搖後隔天室溫再搖1小時來增強binding 如果這樣做是否就不建議用我上述提到的reuse方法？ 先謝謝大家了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.248.116.194 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493063809.A.8D4.html ※ 編輯: MLSHBen (111.248.116.194), 04/25/2017 04:06:31 ※ 編輯: MLSHBen (111.248.116.194), 04/25/2017 04:07:04
推 moon0126: ECL後，stripping再blocking，洗乾淨後直接TBST放冰箱04/25 04:25
→ Ianthegood: pvdf不熟, 不過nc一抗或blocking都可以o/n, 不過沒有04/25 05:07
→ Ianthegood: 在看磷酸化就是了04/25 05:07
→ satantaco: 磷酸化偵測工具推薦https://www.tymora-analytical.com04/25 09:24
→ satantaco: 有western blot的產品 代理商 捷昇生物科技04/25 09:25
推 taya1991: 泡在牛奶裡..一兩天沒問題!!04/25 09:50
推 taya1991: 泡在牛奶裡..一兩天沒問題!!04/25 09:50
→ taya1991: 放TBST 可能..比較怕糊掉？ 我會放牛奶啦 參考參考XD04/25 09:51
→ taya1991: 放TBST 可能..比較怕糊掉？ 我會放牛奶啦 參考參考XD04/25 09:51
推 qiet: blocking O/N04/25 11:50
→ qiet: 穩的04/25 11:50
所以真要這樣做的話4度5% BSA blocking o/n其實是OK的？ ※ 編輯: MLSHBen (140.112.4.209), 04/25/2017 13:04:18
推 melaleuca: 就blocking o/n吧 BSA我會用2% 背景比較乾淨04/25 14:55
推 melaleuca: 磷酸化抗體一定會先看 因為都是重要data 且一般抗體通04/25 14:57
→ melaleuca: 常比較強 如果燒掉就悲劇了04/25 14:57
推 melaleuca: 一般一抗應該是可以重複用兩三次 但每個抗體不同 需要04/25 15:03
→ melaleuca: 測試 例如internal control系列我有試過十次 如果擔心04/25 15:03
→ melaleuca: 隔天再補一點新鮮抗體進去就好04/25 15:03
→ tz2733: transfer完 沒要直接blocking 就過甲醇放乾就好...要用前04/25 22:55
→ tz2733: 再過甲醇 用H2O或TBS洗掉甲醇 接著就可以blocking 1Ab....04/25 22:55
→ tz2733: 如果膜要放TBST裡暫存 不要放太長時間(一個晚上ok) 不然04/25 22:55
→ tz2733: 蛋白會掉 抗體reuse很ok 訊號變弱再加新抗體 磷酸化蛋白04/25 22:55
→ tz2733: 重點在收樣品時的狀態 還有樣品保存情況 訊號太弱就加抗04/25 22:55
→ tz2733: 體濃度04/25 22:55
推 Ianthegood: 專業的來了04/26 00:18
謝謝大家的建議 可以問一下收磷酸化蛋白的樣品需要特別注意甚麼嗎？（雖然有點離題了） 我的RIPA buffer裡是有含1% protease inhibitor和1% phosphotase inhibitor 我的RIPA buffer裡是有含1% protease inhibitor和1% phosphotase inhibitor sample凍-80，但為了不增加freeze/thaw次數有考慮想要分裝，然後用sample buffer凍-20 (有聽說protein用sample buffer處理過後凍-20是OK的) 謝謝 ※ 編輯: MLSHBen (111.248.116.194), 04/26/2017 00:54:48 ※ 編輯: MLSHBen (223.137.125.118), 04/26/2017 03:33:12
→ roy047: protein煮過後放-20還是會慢慢degrade 04/26 04:01
推 Ianthegood: 盡快跑完囉 短期可以 04/26 05:21
→ satantaco: RIPA BUFFER也要留意保存跟使用方法 04/26 09:06
推 tynse71864: 能現收現跑最好囉 04/27 00:02
→ tynse71864: 另 membrane若要保存較長時間， 我會丟 TBS 裡 04/27 00:03
→ raiyu: 小小分享 曾經牛奶4度過週末 週一來發現牛奶臭掉了 囧 05/03 22:01
→ raiyu: 第2個問題 建議參考之前我在板上有問過-20能保存多久的問題 05/03 22:04