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各位版友大家好,目前正在做NRK52E這株細胞做westen,在壓actin確定定量時發現,隨 著細胞代數越高,做出來的ben也越來越高...製作westen前有用elisa定量,定量結果皆 在0.995以上,想問有做這株細胞或是在做細胞westen的版友有沒有發生類似的情況? P.S實驗室4個人所製作的結果都一樣,actin皆是最大代數的sample ben標高。 P.SS把actin改成GAPDH結果也是一樣。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.23.25.91 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493189999.A.0C2.html
Ianthegood: western band 04/26 16:30
Ianthegood: 定量結果怎麼會是0.995 那個應該是你的R square 04/26 16:31
Ianthegood: cell lysate定量後跑膠染個coomassie或是銀染吧 如果 04/26 16:34
Ianthegood: 有明顯的pattern不一樣那你這個line就不適合在沒有其 04/26 16:34
Ianthegood: 他control的情況下做不同代數間的直接比較 04/26 16:34
palo1930: 謝謝修改 情急之下自創不少單字.. 04/26 16:54
palo1930: 目前被要求要找出飆高的原因,究竟是在最後收細胞時發 04/26 16:58
palo1930: 生問題才造成飆高還是其他原因(比如手殘、定量不準) 04/26 16:58
e104582001: 先染coomassie or ponceau S 確定總蛋白一樣多 04/26 17:22
palo1930: 剛剛得知新消息...當初在收細胞時各line的濃度本來就不 04/28 11:08
palo1930: 依,想請問這樣也會影響WB的band? 04/28 11:08
Ianthegood: 細胞濃度不一樣?啊你定量是在做功德的喔 04/28 16:00
Ianthegood: 幾頁前有一群文章wb control 定量 先去看完 04/28 16:02
tynse71864: 細胞濃度是指 數量還是蛋白量呢? 04/28 23:07
palo1930: 數量.. 04/29 08:40
Ianthegood: 我幫你整理一下厚,你說你收了不同代數的不同數量的 04/29 20:42
Ianthegood: 細胞,用elisa定量後(用elisa定我也是很好奇,也沒講 04/29 20:42
Ianthegood: 用哪隻抗體做elisa),得到Rsquare,沒講有沒有做任何 04/29 20:42
Ianthegood: 樣的normalisation,跑膠壓western,得到的actin不一 04/29 20:42
Ianthegood: 樣粗。是這樣嗎? 04/29 20:42
blence: 他說的0.995應該是standard R^2,不是定量的OD,Elisa定量應 04/29 21:27
blence: 該是指用multiplate reader測bradford或BCA的結果 04/29 21:30
Ianthegood: 我也覺得是r^2啊 但是他也沒放任何的quantitation 04/30 03:35
palo1930: 0.995是用標準蛋白加入96 wall後使用Elisa, OD 590下去 05/01 11:05
palo1930: 跑,得出的數值計算R^2,在加入標準蛋白也會加入欲側sam 05/01 11:05
palo1930: ple。(第一次發問交代的不清楚不好意思) 05/01 11:05
palo1930: "再"加入,欲"測" 05/01 11:06
palo1930: I大說的是!是收了不同代數、不同數量的細胞,經過elisa 05/01 11:10
palo1930: 標準蛋白定量後組成跑WB的sample,但是得出來的actin及G 05/01 11:10
palo1930: APDH 粗細卻不一樣。 05/01 11:10
Ianthegood: 這個blence兄要不要處理一下 05/01 15:49
blence: 我的想法就那些,你都說完了阿 05/02 06:25
blence: 從原po描述用詞,有像教的學長姊只講操作流程沒教方法原理 05/02 06:46
blence: 如果是這樣,老師應該要來解決,而不是埋頭苦做 05/02 06:50
palo1930: 謝謝B大,也講到一個重點...只有教流程沒有教原理,這 05/02 16:35
palo1930: 部分會自己再和老師討論和進修!撇除流程滿多東西都是 05/02 16:35
palo1930: 自己摸索所以一知半解,謝謝 05/02 16:35