[求救] WB strip strip可信度

[k60351p (misakilin)]

想問一下版上的前輩們
我最近在跑WB
想看某個KINASE的磷酸化
依照別人的建議是先壓PHOSPHO
再壓TOTAL
但第一次結果出來磷酸化的確有改變趨勢
但是TOTAL的部分也有改變的現象
不確定是否是strip所造成的誤差還是什麼?
（internal control沒問題，抗體是abcam，commercial stripping buffer）

想問phospho跟total在同一個位子
用strip壓是否有可信度的問題?
（sample量有點多，如果都要跑二重覆會有加不完的班。。。）

另外想問，如果壓出來的band偏淡，而且背景較深，是應該調二抗還是一抗的比例?還是應該調整blocking的方式
（5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗體（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000）

麻煩大家給我一點意見，謝謝

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.230.78.34
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493301013.A.52D.html
→ Bows: totel 也是有改變的可能，背景可以用 2~5% BSA 做blocking
好喔～下次換blocking方法看看，但是好怕被罵燒錢QQ
推 milkpa: 有影響，有遇過磷酸化跟一般抗體會競爭的，所以後來直接
→ milkpa: 跑兩片以internal control做比較。（遇過reviewer要求
→ milkpa: 「所有」WB三重複的，實驗室總動員做到死.....）
希望我畢業前不用投稿or遇到兇猛的reviewer ....
※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:01:50
※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:02:42
推 ararthur: Phospho protein 建議用BSA blocking 所以total protein
→ ararthur: 也必須用BSA blocking 我覺得是blocking buf的問題
→ ararthur: 另外 total protein 本來就可能會變化 特別是隨著磷酸化
→ ararthur: 的比例變化 因為該treatment大概就是需要這蛋白活性 量
→ ararthur: 也通常跟活性成正比