[求救] transformation 瘋狂爆盤TT

[inu0001180 (MIKE YU)]

我想請問各位大大，小弟先將要的片段PCR P出來，在gel extraction 將要用的片段弄乾
淨後，ligation 到Yeast T4DNA vector放室溫20min~30min後放到4度overnight,隔天要
做的時候，再將ligation DNA回到室溫20min~30min後在將ligation DNA加入1/3未融的DH
5a ，回插冰上30min然後放到42度heat shock 1min瞬間回插冰上5min,加入1mlLB broth,
移到37度incubator搖30分鐘，取100ul未離心先塗盤，在用3000轉5min慢速離心，將上清
液去除，留100ul 將菌團打散100ul塗盤，放37度incubator16hr,隔天取樣，plate中心皆
有藍白菌落大概20-30顆，但plate周圍都是滿滿的爆盤，做了好幾次都這樣，菌液也都有
塗乾，不知道為什麼會這樣請大家幫幫忙，還挑不到正確的菌落中
http://i.imgur.com/TOwUZit.jpg
http://i.imgur.com/OOj1gD5.jpg

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→ lail: 你的問題是？這樣看起來還好啊
→ blence: colony數量還好,外圍的問題應該是plate問題
→ blence: 敘述中沒提到任何處理,最後怎麼會有藍白菌落
→ blence: 不過,如果DH5a是買來的,這樣步驟長出來的效率頗差
→ inu0001180: 謝謝大大們指教，小弟是用（50ul LB Broth+44ul x-gal
→ inu0001180: +30ul ap+7ul IPTG)去塗盤在LB盤上 . DH5a我都是用CaC
→ inu0001180: l2的方式去做處理，小弟是想問plate周圍是沒推開還是
→ inu0001180: 菌死整片，因為我幾乎推到都快推不動了
→ asd03082002: 大部分的菌液都被推到邊邊了吧？能分享一下你塗盤的
→ asd03082002: 手法嗎
→ inu0001180: 我都將菌液滴在中間 然後左手轉盤右手拿三角啵棒順時
→ inu0001180: 鐘劃圈
推 VincentYan: 菌液是塗到乾嗎? 我不會塗乾，塗抹均勻後放烘箱自然烘
→ VincentYan: 乾約1-2 hr，再翻面