[方法] DNA purification(~30kb)

[kaofei (phoebe)]

大家好，前情提要如下：

我用T4 ligase黏了一段大概近30kb的dsDNA

之後要做in vitro transcription

理論上我應該要跑膠切膠純化...= =

但這個步驟感覺會lose很多 (看到比較適合的是Zymo的，約50-70%大片段回收率)

所以我就只純化接著往後做看看

所以我想問的是

我看qiagen blood & tissue他們elute最主要的就是約30kb的DNA

但第一次離心前我應該要有個DNA binding的動作

blood & tissue裡沒有

我想到的作法是：

1. ligation 200+ 加酒精 200跟buffer AL 200 離心然後之後AW1、AW2...
2. ligation 100+ mini裡的PB binding buffer 500，離心，然後AW1、AW2...
3. Isopropanol沉澱法
   但我不是很熟要怎麼調整鹽類的濃度...有人可以指點我一下嗎orz

不知道有沒有人這樣modify過或類似經驗可以分享看看

謝謝>"<




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→ Ianthegood: 你是黏完linear的直接做ivt? 不先clone起來?
→ Ianthegood: isopropanol precipitation有鹽沒鹽基本上沒差反正你
→ Ianthegood: 要調整到300mM NaOAc (或其他適合的鹽)
→ kaofei: 30kb要clone的話就要用pBAC了吧...但我家沒有那種Vector
→ kaofei: 所以只要加NaOAc就好~但又有沒加沒差是說沒有也可以囉XD"?
→ Ianthegood: 你裡面原本有什麼鹽沒差 不加naoac你就等著離半天都
→ Ianthegood: 離不出東西XD
→ Ianthegood: 我是覺得想辦法clone起來比較好 如果你下游出錯你還要
→ Ianthegood: 從ligation開始做 感覺很蠢
→ silverberry: 同推先 clone 出來。30 kb 有 mutation 怎麼辦?
→ silverberry: 然後建議用 QIAEX II，最大可以抓到 50 kb。
→ silverberry: 實戰用過 55 kb 沒問題。