[討論] protein保存在7M UREA還容易裂解嗎？

[REIDO (NEET)]

我最近在分析ECM，先用guanidin萃取，因為要跑SDS-PAGE，所以還有透析
凍乾再用tris+UREA 7M回溶放-20°C。

因為跑膠發現趨勢不太對，所以重新BCA定量，雖然每次3重複定量的準度很高，但
不同次定量卻會有差異。

我的問題是，這個差距是怎麼造成的？

有猜過proteinase inhibitor作祟，因為從透析開始就沒有inhibitor了。但
反過來說，ECM應該也不好切吧？每次trypsin過後盤子上還是一堆。

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最近你的吸引力將大幅上漲，周遭的異性將慢慢的被你迷惑，慢慢的開始愛上你......。

唯一美中不足的是───────那群異性中有一半以上是齧齒目，其餘的則是爬蟲類。


或是你也可以換個樂觀的角度───愛上你的只有不到一半是爬蟲類，其餘都是齧齒目。

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推 joseph103331: 重複解凍嗎? 還是同一批分裝?
→ REIDO: 重複解凍
→ joseph103331: 那有可能是重複解凍造成的蛋白質裂解,其實Urea放在
→ joseph103331: 4度就很穩定了,蛋白質樣本要放在-20或-80還是分裝
→ joseph103331: 比較安全
→ joseph103331: Urea回溶的sample放一般冰箱能存多久我不知道,我有
→ joseph103331: 一隻樣本放了半年跑膠看起來沒甚麼差別
→ REIDO: 請問為何重複解凍會傷害protein？
→ REIDO: 所以用UREA不需要擔心protease的影響嗎？
推 tynse71864: 結凍會使某些蛋白易斷裂 (？)而失活
→ joseph103331: 用guanidine萃的時候不加inhibitor應該也沒關係
→ joseph103331: 蛋白質在urea或guanidine的狀態都是denature的
→ joseph103331: protease會直接失活,所以不會有太大影響
→ joseph103331: denature時重複解凍的降解就是鍵結斷裂,詳細不明XD
推 july81212: 凍乾後保存要用時在回溶比較好吧 在liquid 內凍時氫鍵
→ july81212: 有時會破壞蛋白
→ REIDO: 了解！不過透析成純水要凍乾這一段，不曉得protease會不會
→ REIDO: 作怪。但又不可能把整個燒杯灌滿inhibitor....
→ kingbar: 有確認過BCA kit能夠compatible的urea濃度嗎？
→ REIDO: BCA寫3M，坦白說我不曉得3M是5X稀釋前還是稀釋後...
推 tynse71864: 記得是稀釋後； 透析體積多大啊
→ tynse71864: 是說我老闆不太建議抽乾凍蛋白，會有抽乾不易回溶或 d
→ tynse71864: egrade問題； 有考慮收細胞時，直接分裝好幾管相同濃
→ tynse71864: 度的，用一次就丟？
推 tynse71864: 沒看到 guandine抽…請省略抽乾那段 Xd