→ xxtomnyxx: 最後產物是環狀的還是線性的？ 05/29 20:43
→ kaofei: 是Linear，但這就有個問題是會不會頭尾ligate變環形...當 05/29 23:40
→ kaofei: 初設計primer時沒想到orz 覺得會是個隱憂 05/29 23:41
→ kaofei: 頭尾是blunt end 05/29 23:42
→ Ianthegood: blunt超難 想接都接不起來 05/30 00:34
→ blence: (我的經驗)幾乎所有ligation protocol都建議RE切完做gel 05/30 00:44
→ blence: elute或cleanup來移除不要的片段,所以overhang不至於掉掉 05/30 00:44
→ blence: 這樣,第一次的ligase也沒有inactivation的問題 05/30 00:46
→ blence: primer一般合成的時候5'沒加P,PCR後頭尾還是黏不起來,不過 05/30 00:50
→ blence: 如果blunt end是切出來的,AE應該可以形成環形了 05/30 00:52
→ icheee: 同上 blence 大大 overhang 在 per cleanup 應該穩定 而因 05/30 17:39
→ icheee: 為已經有 cleanup 所以不需要事先 inactivate ligase 05/30 17:40
→ kaofei: 嗯嗯，謝謝大大們的回答。所以如果都是PCR產物，頭尾Blunt 05/30 20:52
→ kaofei: end接的機率不高，兩次ligation中間也不需要inactivation 05/30 20:53
→ kaofei: 我是都有cleanup。會擔心頭尾接是因為我之前cloning都是 05/30 20:55
→ kaofei: 都用pJET2.1，是blunt-end ligation..但可能kit還是不一樣 05/30 20:56
→ blence: 狀況不同,pJET blunt-end有P,PCR product可直接接進去 05/30 21:31
→ blence: 但你的A,E如果是PCR形成的blunt-end,兩端都沒P阿 05/30 21:37
推 joseph103331: 如果site都不一樣的話,就用RE切切看產物就知道有沒 05/31 01:23
→ joseph103331: 有形成環形了,也有可能只是跑膠誤差啦 05/31 01:27
→ kaofei: 好的！謝謝大大們熱心解惑Q__Q！有Biotech版真好 05/31 09:58
→ xxtomnyxx: 對了，溶DNA的buffer如果和marker的buffer差太多，也會 05/31 16:01
→ xxtomnyxx: 影響DNA跑的位置 05/31 16:01
→ Ianthegood: 看你是用什麼buffer system跑啦 tae其實對buffer salt 05/31 18:34
→ Ianthegood: 的tolerance極高... 05/31 18:34
→ kaofei: 我們家都用TBE耶，會對鹽類比較不耐嗎？ 05/31 21:57
推 Ianthegood: 如果是la或lb這種次世代的就會比較敏感 tae tbe都滿耐 06/01 04:39
→ Ianthegood: 的 06/01 04:39