[求救] 鹼性環境的His-tag純化

[s992003 (Lord of Ethanol)]

小魯又來了，謝謝先前大大們的意見

之前一直在嘗試用e.coli表達純化

後來發現不論怎麼用 蛋白幾乎全部都卡在固體中
老闆認為應該是inclusion body
改用低溫表達結果幫助不大

最後決定純化inclusion body的蛋白
參考paper的方式用輕微變性的方式溶解固體

首先用含有lysozyme、PMSF的buffer收菌pellet
利用冷凍解凍再sonication破菌

10000g離心後再分別用1%、2%triton洗掉脂質膜
接著用1M NaCL清洗、再用DDW 清洗

這個時候的pellet其實沒什麼變化，感覺沒有洗掉inclusion body以外的東西

但還是繼續做
用2M urea pH 12.5的 buffer搖晃8小時 溶解固體
16000g 離心30分鐘，這時候的固體變很少了，已經溶解大部分
（這部分跑膠過了，有蠻多我的目標蛋白，還算乾淨，背景沒有很多雜band)

取上清液與NTA-beads binding 2小時
後面就用10、20mM 的imidazole清洗
然後用250mM imidazole elute
發現好像beads上吸的蛋白沒有很多

可是照吸附原理來看
應該是pH越高 histag越容易吸上beads
但結果看起來不像
Beads說明書是說pH大於12的話binding不要超過2小時，怕beads被破壞之類的？

另外除了binding不好之外
Elute的效率也沒有很好
還是說250mM的濃度其實不夠

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→ VVade: 這哪個實驗室設計的實驗...
→ s992003: 我們在清洗inclusion body比較粗糙 因為藥品都還沒來 但2
→ s992003: M urea pH12.5是paper 的條件
→ Ianthegood: ib裡面應該不會有太多你的蛋白以外的東西 你就收ib就
→ Ianthegood: 好 不用再過column了啦
好的我們後來發現真的不需要過column了，ib洗乾淨的話真的都是我們要的蛋白
推 huangsw: 要看你的蛋白用途阿, 另外pH太高, 很多resin撐不久
我們希望蛋白仍保有活性，後來有paper說ib不見得一定是無序糾結，我們才嘗試走這條路
推 joseph103331: Binding不好是怎麼看的? Wash有一起檢查嗎?
跑膠看binding前後的上清液 發現目標蛋白看起來沒減少，但beads理論上的吸附容量蠻大的
感覺binding後的液體目標蛋白應該要明顯減少?
※ 編輯: s992003 (140.128.123.73), 06/13/2017 17:11:29
→ bloodgas: IB裡的蛋白已經很純了不用再nickle純化了，主要是復性
→ bloodgas: 之後有沒有正確摺疊