推 joseph103331: 我是在想 你的primer前面怎麼沒有多幾個bp? 07/11 17:46
→ joseph103331: 這樣能切嗎? 然後我去google T vector,查到pGEM-T 07/11 17:47
→ joseph103331: 可是上面沒有BamHI阿... 07/11 17:47
→ lail: 單獨切試試? 07/11 17:52
→ lail: 然後定序，看一下enzyme site是不是正確 07/11 17:53
推 ampicillin: NotI前面不加mer是切不下來的喔 (NEB說的) 07/11 18:32
推 ampicillin: 啊我目小沒看到TA cloning 07/11 18:42
→ xxtomnyxx: 推定序，另外確認下你的酵素是不是 HF 版本的 07/11 18:44
→ ganbaba: 試試用TA附的F&R primer p出來再切然後接到你的載體吧 07/11 18:52
推 Ianthegood: 兩個都沒切嗎?還有沒有supercoil的plasmid? 07/11 19:04
→ blence: 看到3.1buffer的用法,會讓人覺得整組實驗有問題 07/11 19:08
→ xxtomnyxx: 欸等等！？你不是把總體積補到 50？是直接下50 uL 的 07/11 20:53
→ xxtomnyxx: plasmid 下去？ 07/11 20:53
推 tynse71864: 2ul會不會太多@@ 07/11 21:25
→ tynse71864: enzyme 07/11 21:25
推 ampicillin: 但咧，你那個buffer體積怎麼...不是1/10? 07/11 21:54
→ tanya1993: blence 我是用NEB double digest finder 去查他倆的最 07/12 00:04
→ tanya1993: 佳buffer的，還是要用哪個比較妥當嗎？ 07/12 00:04
→ tanya1993: xxtomnyxx 因為想要大量切膠回收，所以就把抽到的質體 07/12 00:06
→ tanya1993: 直接全切下去，我第二組條件就有把buffer用1/10的比例 07/12 00:06
→ tanya1993: 下去了 07/12 00:06
→ tanya1993: 今天有嘗試分別切切看了，決定先放overnight看看 07/12 00:12
→ tanya1993: ampicillin 想問一下，因為是初次接觸重組基因這塊， 07/12 00:17
→ tanya1993: 當初在設計primer，我其實還未了解限制酶前面要多加mer 07/12 00:17
→ tanya1993: 這觀念，因為看之前學長都沒有加而且有順利切下，所以 07/12 00:17
→ tanya1993: 覺得沒有影響。那請問是因為有Tvector的關係所以才不 07/12 00:17
→ tanya1993: 用額外加其他mer嗎？ 07/12 00:17
→ blence: 第二次,如果50ul是plasmid體積量,那還是不符合1/10 07/12 00:19
→ blence: 第一次的digest如果不是錯字,基本上不該出現這的做法的 07/12 00:21
→ blence: 會採用不符合1/10的操作,暗示整個cloning過程會有未知錯誤 07/12 00:24
→ blence: RE site後面多加mer的部分,因為你用TA,這不需要煩惱 07/12 00:25
→ blence: 反而是為了配合TA而用Taq時,未訂序直接往後做怕會有mutant 07/12 00:28
→ blence: 還有就是老問題了,文中標示總量或濃度比較能看出問題, 07/12 00:29
→ blence: 而不是體積;另外cloning的試劑,有廠牌訊息也方便辨識 07/12 00:31
→ blence: 還有><,你查到的NotI只對CpG敏感,用DH5a完全不用擔心這個 07/12 00:33
→ lail: 其實切得動的話，放1小時就會切了，不需要到O/N，尤其你又只 07/12 07:34
→ lail: 是要測試而已 07/12 07:34
→ huuban: 有沒有測濃度啊?會不會太濃了然後buffer量又不對? 07/12 23:52