[求救] phenol-chloroform的貯存時間...

[kaofei (phoebe)]

我因為某些原因需用傳統法純化ligation完的DNA

再買新的試劑前發現實驗室有放很久很久(可能超過五年吧= =)

的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1)

一直冰在四度c，棕色瓶，顏色還是純淨透明的 (有可能還沒開過)

聽說這個試劑的萃取效率會逐漸變差

我看大部分的有效日期頂多到一年

想請問這樣還可以用嗎= =?



今天有拿plasmid試著抽，方法大致如下 (有可以加強的麻煩指點>"<)

100 ul DNA與試劑等體積混合均勻後

13000 rpm, RT離5分鐘後取水層 (沒有repeat)

直接進酒精沉澱

先加0.5倍體積的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍體積的100%酒精

-80三小時

然後15000 rpm, 4度c 30分鐘

之後用預冷的70%酒精wash兩次 (只有第一次有看到pellet)

air dry，用PCR grade water回溶

測得濃度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多...





我之後純化完的DNA要用做ivt的template

之前都用column純化，但好像量會比較少，也沒法去除endogenous RNase

所以就被建議用傳統法抽，但目前實驗室沒人有經驗

所以想請問版上大大相關的問題，以及操作上要注意的地方

還請不吝回答orz謝謝

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※ 編輯: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:53:47
※ 編輯: kaofei (101.0.152.172), 07/23/2017 22:54:19
推 tynse71864: 沒印象要加 ammonium acetate耶
→ Ianthegood: 要加阿 我學的protocol是加1/10體積的5M amonium acet
→ Ianthegood: ate 不過多加好像也沒差
→ Ianthegood: wash離久一點唄
推 tynse71864: 我直接加純酒精-20度，1h就離心了
→ kaofei: 也有人加3M sodium acetate但我不曉得跟Ammino有甚麼差
→ kaofei: 所以，PCI放這麼酒還是可以用的嗎？是否沒變紅就是沒氧化
推 tynse71864: 試過 Na acetate; 用途跟 ammonium acetate應該都是增
→ tynse71864: 加離子濃度，讓 dna更易被EtOH沉澱下來
推 tynse71864: 我家的 PCI是放了快3年囧 但還能抽的出來
推 joseph103331: 不夠純的話PC可以萃兩次囉