Re: [討論] 三重複定義--問題二

[aaaazzzz (找英文家教)]

※ 引述《day112 (ken)》之銘言：
: As title
: 通常細胞實驗都會要求 three independent test
: 但最近遇到我覺得蠻困惑的問題，
: PI 表示用同一組sample triplicate 即可。
: 我自己是定義這種叫技術性三重複啦......
: 但我以為所謂三重複應該是biological repeat,這個實驗室貌似認為首先biological rep
: eat不容易，二來技術性三重複的SD才會小，data才漂亮。
: 想請教板上先進前輩，所謂三重複的定義是什麼呢?
對於d大提到的說法，

的確是有點誇張，

正常的PI不會想把sample跑三次，

(d大實驗是醫生嗎？有大數據的概念，還是有鑽研過過統計？

知道要達到統計上的差異，一個是增加樣本數如同樣實驗做個一百次，

但因N無法大就想辦法讓SD儘量縮小)

尤其現今又有"Simple Western"，

同樣的sample load進去，

Error bar極小，(或者根本一模一樣吧)

照d大實驗室的說法，

只要做實驗一定有統計上的差異。

(只是別人無法repeat，下次實驗室另外個成員來做，結果可能相反且還是有統計差異)

對於三重複我也有些疑惑，

為了簡化問題，

以下都以Western blotting的例子來提問，

大家常用的作法應該是使用三代的細胞分三個不同時間跑？

還是趕時間直接分成三組細胞？

使用三代的細胞來跑應是符合多數人的認可，

但假設加了A藥之後，

實際上(指多數有經驗的操作者)會造成實驗組B基因的表現相對於控制組上升20%，

老闆預期的結果也是實驗組相對於控制組要得到上升的趨勢，

利用三個時間點來跑，

實驗組相對於控制組可能得到105%, 120%, 135%，

但上面的結果很遺憾沒有達到統計上的差異，(以雙尾p<0.05視為統計上顯著差異)

以WB來說因為步驟繁瑣，

沒跑過上百片技術上要小於20%真的很有難度，

(還有某些實驗先天上的誤差根本就超過這數字)，

所以對於某些paper用定量在band上標示個1, 1.1(但視覺看不出差異)，

實在很難讓人相信這樣的實驗能夠repeat。

因此，所以我會告訴學弟妹找題目要找個倍數相差很多的，

最好差個100倍，(但通常沒這麼好做的題目，這種題目一定很容易發現，

老早就被做光了)

因為我知道碩班二年的訓練(實際做實驗一年半就要偷笑了)，

要讓實驗誤差極小是不大可能。

回到剛剛的例子，(指實驗組相對於控制組得到105%, 120%, 135%)

上述的狀況大家會多做一組以達到統計上差異嗎？

還是PI就說直接取135%的圖，看起來差異最大，不須多跑？

同樣的例子，

(實際上(指多數有經驗的操作者)會造成實驗組B基因的表現相對於控制組上升20%，)

讓一個新手操作，他得到實驗組相對於控制組的數據為70%, 120%, 170%

(平均仍為120%)

可以注意到第一組的樣品(實驗組相對於控制組)看起來是下降，

但另外兩組的樣品是上升，

想請教各位的老闆的作法會如何呢？

(1)讚，取170%那一組，這新手做的圖差異性比老鳥還棒

(2)已做三重複，趨勢大致呈現上升，符合預期，準備下一步的實驗

(3)雖然做三重複，但二上升一下降，再多做一次，至少要有三次上升的結果

(4)再做個幾組，例如後來得到150%, 160%，到時去掉70%與120%，

取150%, 160%, 170%，就能有統計上差異

(5)為了追求科學真理，要不斷重複，直到統計上的p值小於0.05

(6)找別人來repeat實驗

再請各位版友提供點實際操作的意見，

雖然這是某種較為苛刻的例子

(實驗組僅較對照組上升20%，但如果確定真的上升就代表對生物體有某些意義，

不能忽視它的存在)，

大家也都知道第五個做法最符合科學，

但第五個作法可能讓一個研究生花了三個月都還在做同一個實驗，

如果手殘，根本沒機會畢業。

再請諸位先進提出見解，感謝！


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推 airrooco: (2) 或 多做兩組，去掉兩端極值
→ blence: WB我只相信方向性,不相信差異倍數,像band下面1, 1.1這種
→ blence: 定量標示,通常是reviewer看不出差異又不求補data時變通用
→ blence: 我也選(2),有秀(5)這種data的,常常都在曝光時間動手腳,用
→ blence: 又粗又肥的band,犧牲差異倍數來縮小variation
→ aj1139: 先說一下我遇到的老闆都選(1) XDDD
→ aj1139: 然後這個例子有點難說，個人非常不相信用WB做的定量結果
→ aj1139: 我通常每個實驗都會同時有兩到三個相同的組別，就算結果
→ aj1139: 都符合預期，但同一個組別之間若差異太大也不可信。
→ aj1139: 以上1~6都是建立在假說為真的前提，我個人則會先懷疑假說
推 joseph103331: 或可以換比較穩定的assay,像是ELISA
→ joseph103331: WB造成差異的可能點太多,抓都抓不出來
→ a910298: 我大學實驗室也是在篩藥，碩士生前期做細胞實驗，後期還
→ a910298: 要做動物實驗和才能畢業。
推 pent: (2) 選5是實驗初期，紮實一點比較好，趕畢業就1 or 2吧
→ aaaazzzz: 感謝各位都很誠實的分享(我本來還以為大家都說5,那就沒
→ aaaazzzz: 得討論了),我個人的想法是碩一生以選項"56"為主,碩二生
→ aaaazzzz: 要趕畢業,可能以選項"12為主,至於博班生有發表paper的
→ aaaazzzz: 壓力,可能以選項"2"(5分以下WB多數只選一張)或"3"(極高
→ aaaazzzz: 分雜誌,要求所有三重複原始data),另外考慮的方式是去看
→ aaaazzzz: 上述B基因的下游,是否也發生對應性的改變
→ aaaazzzz: 至於選項"5"這麼科學,不斷重複同樣實驗(不靠刪實驗組別)
→ aaaazzzz: ,好像從沒聽到有實驗室這樣經營過(同樣實驗如果重複五六
→ aaaazzzz: 次,這時候PI應會不耐煩的問實驗者:"你認為到底是上升或
→ aaaazzzz: 下降,還是根本是手殘?")
推 day112: 我老闆不是醫生 至於這一題以我老闆來看 我不知道他會怎
→ day112: 麼處理 因為他不看原始數據 我個人習慣是3、4 但實驗室其
→ day112: 他人我就不好說了ㄏㄏ
→ day112: 至於刪極端值達統計意義，我們實驗室為了增加N會再補一個
→ day112: 平均值進去......
→ aaaazzzz: 我也認同d大看法，5的科學再現性最高，34的科學再現性其
→ aaaazzzz: 次(可能5-8成的別家實驗室可以重複)，12再現性最差(我已
→ aaaazzzz: 遇到好多次了，同樣的細胞，同樣廠牌的藥物，同樣的時間
→ aaaazzzz: 點，做起來的結果就是與paper的結果不同)
→ ghjkl1478: 5不太可能 太耗時了 通常是4 增加N值確定趨勢後
→ ghjkl1478: 挑顯著的幾組成為3重複 不過我同意這種作法會讓自己的
→ ghjkl1478: 研究根基越做越不穩 所以實驗室的研究方向最好盡量
→ ghjkl1478: 開廣一點 而不要單點突破的直衝深度
→ aaaazzzz: 對於g大的看法，讓我聯想到實驗室大者恆大，因為有較多
→ aaaazzzz: 的資源，可以針對不同廣度多方佈局，即使回收率僅二成有
→ aaaazzzz: 支持假設的證據，也能生產足量的文章以申請經費，維持實
→ aaaazzzz: 驗室的運作。反之小的實驗室可能就得有一段艱辛的路程要
→ aaaazzzz: 走...