Re: [求救] phenol-chloroform的貯存時間...

[kaofei (phoebe)]

想來自己update一下使用心得順便問問大家意見orz

我後來pheno-chloroform extract了三次才進到ethanol precipitation

第一個步驟是-20 overnight然後才去離心

airdry大概10分鐘內，pellet從白色變得有點半透明我就加水elute。

測得濃度有點驚人

~700 ng/ul，但OD很可怕是3.78 260/280，peak大概260稍偏280一點

我們的機器無法看230。

呃...我還沒往下做ivt，因為這麼高的OD從來沒見過

查網路大部分討論的是過低的情形，比較少論及OD太高代表的意義

有人說是RNA汙染，但是我的Sample是PCR product或plasmid切割後ligate在一起的

所以這個可能性有點低

如果是phenol的污染會這樣嗎？

我是否需要再做一次純化比較妥當？

謝謝！




※ 引述《kaofei (phoebe)》之銘言：
: 我因為某些原因需用傳統法純化ligation完的DNA
: 再買新的試劑前發現實驗室有放很久很久(可能超過五年吧= =)
: 的phenol-chloroform isoamyl alchohol (25:24:1)
: 一直冰在四度c，棕色瓶，顏色還是純淨透明的 (有可能還沒開過)
: 聽說這個試劑的萃取效率會逐漸變差
: 我看大部分的有效日期頂多到一年
: 想請問這樣還可以用嗎= =?
: 今天有拿plasmid試著抽，方法大致如下 (有可以加強的麻煩指點>"<)
: 100 ul DNA與試劑等體積混合均勻後
: 13000 rpm, RT離5分鐘後取水層 (沒有repeat)
: 直接進酒精沉澱
: 先加0.5倍體積的 7.5M ammonium acetate然後加2.5倍體積的100%酒精
: -80三小時
: 然後15000 rpm, 4度c 30分鐘
: 之後用預冷的70%酒精wash兩次 (只有第一次有看到pellet)
: air dry，用PCR grade water回溶
: 測得濃度只有原先的0.4倍，260/280只有1.5多...
: 我之後純化完的DNA要用做ivt的template
: 之前都用column純化，但好像量會比較少，也沒法去除endogenous RNase
: 所以就被建議用傳統法抽，但目前實驗室沒人有經驗
: 所以想請問版上大大相關的問題，以及操作上要注意的地方
: 還請不吝回答orz謝謝

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→ blence: 260/280這麼高,大概斷光了,跟直接測dNTP一樣吧
→ kaofei: 但我跑膠沒有斷光耶...不過Comb那邊亮亮的讓我覺得有點怪
推 Ianthegood: pci後有過一兩次chloroform嗎? 把殘餘的aqueus phenol
→ Ianthegood: 洗掉
→ Ianthegood: ivt也沒多貴 跑一個rxn下去就知道啦XD
→ kaofei: 沒有耶..因為看有的protocol沒寫想說也許不必要...orz
→ kaofei: 我以為ivt挺貴的..可能我有加cap吧，平均一個rxt要7k多啊.
推 joseph103331: 可能是沒ligate的東西造成的?
推 joseph103331: 需要乾淨一點還是再用chloroform萃過一次較好
→ xxtomnyxx: 我的經驗上 P-C 酒精沉澱純化的 DNA 260/280 都很容易
→ xxtomnyxx: 異常高，原因不明，把產物再過一次 PCR-cleanup Kit 後
→ xxtomnyxx: 260/280 就會正常
→ Ianthegood: 喔哇嗚你的kit好貴 真核的嗎?
→ kaofei: 是說表現系統嗎?  啊我其實是要用來Rescue ssRNA病毒的...
→ kaofei: 欸我算錯了，是700多XDDDDDDDDDDDD"   阿好白癡
推 yfw: DNA降解了
推 yfw: 建議重抽 不要交談 確定環境還有手套都是乾淨的再抽