[求救] ELISA 結果相反

[pring (pring)]

最近在做ELISA 出現了陽性血清陰性 陰性血清陽性的結果
（陽性血清為之前攻病毒所得來的 所以非常確定它是陽性；
  陰性為同一隻動物攻毒前的所搜集的血清）

我做的方式為
(1) coating三種不同的蛋白 （一樣的濃度 2ug/cc) 4度C overnight
自己純化的病毒蛋白A、自己純化的病毒蛋白B、濃縮全病毒

兩者純化的蛋白都是用HEK細胞所表現的，
A蛋白為soluble protein 取其上清液做純化
B蛋白為membrane 取其細胞 並用lysis buffer 過filter後純化

純化方式也都一樣使用
使用resin (TALON Superflow）binding
透過高濃度的imidazole elute蛋白出來

(2)blocking 1hr, RT
(2)血清稀釋的倍數(一抗）也都一樣 1hr, RT
(3)二抗稀釋的倍數也一樣 1hr, RT
(4)呈色劑也是一樣的條件

自己純化病毒蛋白A 與 濃縮全病毒的結果 為正常
但是自己純化病毒蛋白B 卻出現了相反的結果

想請問大家有相同的經驗過嗎？或是我該做什麼樣的調整?


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※ 編輯: pring (140.112.231.135), 08/01/2017 23:34:32
※ 編輯: pring (140.112.231.135), 08/01/2017 23:46:53
→ lail: 只做了一次嗎?
pring:重復做了很多次 也試過不同的陰性及陽性血清
※ 編輯: pring (140.112.231.135), 08/02/2017 01:28:22
→ Ianthegood: data永遠是對的
推 joseph103331: 相反是指都很低, 但陰性高 陽性低嗎?
→ pring: 是指考慮nonspecific binding嗎？