[求救] PCR產物大小錯誤，但質體構建成功

[chan50515 (姆哈哈～)]

大家好，最近實驗遇到一個問題
先簡述實驗內容：
1. PCR vector and insert
2. Digest with enzyme
3. Ligation

第一步驟PCR完大小是錯誤的
預期vector大小約為4.9k bp (原始質體大小5.9k bp)
但agarose gel結果顯示卻不是如此 (如附圖)
http://imgur.com/9k2QSmi

但由於PCR結果十分專一，因此我還是回收後做酶切
大小一樣比預期中的大 (如圖)
http://imgur.com/5ODd62M


雖然大小未跟預期的相同
我仍然繼續往下做vector and insert ligation

最後轉化及驗證結果
是以colony PCR insert及酶切2刀確認質體大小
皆為我要的質體 (構建成功)

想問問大家是否有遇過這種狀況?

以下為我PCR的所設定的program

94C, 5 min
94C, 40 s  ----
55C, 30 s     |-30 cycles
72C, 3 min ----
72C, 10 min


第一次遇到這種狀況
想請問有沒有人知道原因？

謝謝!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.116.168.31
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1503404096.A.AE8.html
※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 20:18:42
推 Bows: vector 用PCR?沒定序過什麼都是假的
→ rasaze: 就像一樓說的定序完再來說成功
好的 謝謝!
→ Ianthegood: polymerase跟膠系統都沒講啊
PCR是使用Ex-Taq
→ Ianthegood: 你insert如果有做對 colony批跟切當然都會是對的size
→ Ianthegood: 啊
→ Ianthegood: 不止要定序 你還得把整個vector都定完
好的! 謝謝你的提醒

→ blence: Vector要PCR大概是沒RE切點,不過放30cycle太多,容易有突變
是的，因為vector與insert沒有相同切點
所以皆須PCR

→ blence: 假使沒切位,使用驗證方法有辦法排除5.9k的污染嗎？
→ blence: 至於產物偏高,使用safe-dye內染的操作是有可能出現的
→ aj1139: 同以上各樓，先定序確認再做吧
好 了解了 謝謝各位
※ 編輯: chan50515 (140.116.168.31), 08/22/2017 22:40:35
推 joseph103331: 原始大小5.9k 產物5.9k,是把原質體的insert一起做出
→ joseph103331: 來啦?
→ Ice9: 我個人其實不太建議原PO在非得使用這個 vector 的情況下這麼
→ Ice9: 做。我的做法會是 vector 切一切，補平，insert 平塞。之後
→ Ice9: 長出來的，再用 PCR 或 RE 先確定順序，再送定序。
→ Ice9: 如果 insert 也是切出來的，那更好了。先將 V/I 切切純化，
→ Ice9: 再設計引子把 V/I 連接後整個 PCR 出來，純化、餵菌、定序。
→ Ice9: 而後者的 PCR 酵表，建議用高規格的。此時通常只定序看切位
→ Ice9: 唔，趕在被打臉之前改一下我的建議做法：
→ Ice9: 先將 Insert PCR 出來純化，引子用含有一部分 vertor 插入位
→ Ice9: 附近的序列。然後以之前的insert為 primer 去對vertor做PCR
→ blence: 上面提到的應該就是two-step site-directed mutagenesis
→ blence: http://tinyurl.com/y9fzz8bw  把insert想像成SDM的primer
→ blence: 文中提到可以1k,我自己<2k都沒問題,但3k以上就沒成功過
→ blence: 原po的方法還是有遇到的機會,不過我比較偏好重新創造MCS
→ Ice9: 我手上做過的 insert，確實沒有超過 2K 過。
推 boblu: 喜歡自己做 cloning site +1
→ satasumi: 換一家MARKER對照看看