[求救] 電轉後細胞會aggregate

[kaofei (phoebe)]

大家好：

想請問電轉mammalian cell的問題。

我的細胞是vero，電轉的核酸是~30k的RNA

protocol大致如下：

細胞會前一天繼代到175T，實驗當天約8-9分滿

Trypsin 2ml下去後等約五分鐘，細胞都變圓變亮後輕敲detach

medium回溶後4度離心，去除上清液

PBS wash兩遍後細胞計數，並回溶到適當濃度 (1x10^7/ml)

將RNA加入細胞(0.8 ml)後加入0.4 cm的cuvette

參數是4 pulses at 450V, 50uF

細胞hood內recover 10 min，transfer到已回溫complete growth medium

隔天觀察細胞


我的問題是，電轉完後我的PBS-cell suspension都會有很多泡泡，這是正常的

但細胞常常會aggregate在一起，變得跟鼻涕一樣濃稠

然後似乎aggregate越多，代表細胞viability越差，會貼下去的細胞越少

但我不太確定這可能是哪個步驟所造成的。


是細胞本人(新解凍約第5代)？

Detachment過程 (trpsin下去後rinse幾遍就會倒掉然後等細胞rounding)?

電轉的buffer?


因為實驗需求，貼下去的細胞之後還要再碰trypsin，所以要有一定的滿度，不然就GG了

不知道有沒有人有經驗可以分享的，有那些小細節我可能沒注意到造成細胞存活下降

還有要怎麼避免細胞Aggregate的問題

大感謝>"<

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.208
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1504581372.A.1FE.html
※ 編輯: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:17:05
※ 編輯: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:18:23
→ xxtomnyxx: 我猜是細胞死掉釋放出 DNA 把細胞纏在一起造成的？
→ kaofei: 我有看到這個說法，也看到有人說可以加DNase來避免，但不
→ kaofei: 知道是否真的可行XD"  或我有辦法後處理把他們鬆開嗎?
推 joseph103331: 是不是吸到泡泡了？電轉的時候我不會去吸那些，那
→ joseph103331: 些是死細胞
→ kaofei: 我就是用1000ul的tip能吸的都吸起來，但我沒用medium
※ 編輯: kaofei (140.112.4.208), 09/05/2017 11:59:02
→ kaofei: 去wash cuvette下次會記得...所以泡跑不要吸，鼻涕樣物呢?
推 joseph103331: 我會用200uL的tip先把結成團的泡泡移到壁上，再盡
→ joseph103331: 量吸剩下的medium，這樣做我沒看過鼻涕樣的東西，
→ joseph103331: 但不免還是有一點細胞碎片就是。
→ joseph103331: 我在想那些泡泡就是細胞糾纏在一起混合鼻涕的東西
→ joseph103331: ，可以試試另外取出來用顯微鏡證實。
→ Ianthegood: benzonase可以試看看