[求救] pTWIN1/nruI,bamHI設計primer

[tanya1993 (幫幫)]

想請問一下
因為想使用ptwin1的CBD-Ssp DnaB INT做純化蛋白
但現在在設計引子，設計後覺得引子有點長，R-primer和F-primer的Tm差有點大，想問一
下，我這樣設計到底可不可行。

F-primer(nruI) Tm76
5’- GTC GCG AAT GAC ATC ATT GTA CAC AAC *GGC CGG GCG GGC CGC TTG AAG AAG* -3'

R-primer(bamHI) Tm63
5’- CGC GGA TCC TTA *TCT TCC TAG TGC CTG* -3’

(*為target protein 序列*)

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→ blence: 設計成這樣總有理由,是什麼？
→ e104582001: 1.一般來說要加上切位的話不會額外多加那麼多mer
→ e104582001: 我自己經驗是依不同的enzyme會外加2~4個mer而已
→ e104582001: 若沒有特殊功能，F的7~27bp有什麼特殊的意義嗎?
→ e104582001: 我平均設計約18(CDS)+8(Cutting site+額外保護用)而已
→ e104582001: 再依據CG%調整總長度
→ tanya1993: F-primer的部分GTC GCG AAT GAC ATC ATT GTA CAC AAC (
→ tanya1993: 是部分intein包含nruI)後端GGC CGG GCG GGC CGC TTG AA
→ tanya1993: G AAG是GRA+target protein
→ blence: 一定要加GRA的話,也可以直接用MCS的NcoI+target gene就好
→ blence: 要是完全不要NcoI的ATG,那也可以設計SapI,不一定要NruI
→ blence: 只是SapI比NruI貴,雖然這麼長的primer也需要多花純化的錢
→ blence: 不過如果gene已經在plasmid上,primer隨便訂也不擔心P不出